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《武汉大学》 2017年
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LncRNA-ANCR调控骨肉瘤细胞生物学行为及相关机制的研究

张飞  
【摘要】:背景骨肉瘤(Osteosarcoma)在青少年以及儿童中发病率较高,为一种常见的原发性恶性骨肿瘤,在所有类型的原发性骨肿瘤中,骨肉瘤的发病率排名第一位,发病率约为6-8/100万。骨肉瘤是一种高度恶性化的实体肿瘤,目前已有大量研究表明,骨肉瘤的发生通常与机体骨骼的快速生长相关。骨肉瘤除了具有发病率高、恶性化程度高,还易早期发生远处转移,大部分患者在发现时已经发生转移或者进入晚期,因此给早期诊断和治疗带来了巨大困难,患者的远期生存率处于较低水平。其不仅给患者和家庭造成严重的心理创伤,还社会增加了沉重的负担。目前临床上常用的骨肉瘤治疗方法是手术加个体化的化疗相结合的综合治疗途径,尽管患者在接受治疗后的5年生存期较过去得到了极大提高。但对于发生骨转移和复发的骨肉瘤患者,依然未能找到行之有效的治疗方法,患者的生存率依然呈较低水平,约为30%左右,因此,寻找骨肉瘤新的检测和治疗标志物是目前医学研究的热点和难点问题。抗分化非编码 RNA(antidifferentiation noncoding RNA,ANCR)属于长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)中的一种,目前已有研究证实其具有分化调控功能。组蛋白甲基转移酶2(Enhancer of zeste homolog 2,EZH2)为表观遗传调控上皮间质转化的重要因子之一,在多种恶性肿瘤的转移过程中扮演着重要角色。EZH2能够在基因水平上对多种基因的生物学活性产生抑制作用,同时还能够显著抑制肿瘤转移抑制因子,因此其能够促进肿瘤细胞的侵袭和转移。目前的研究表明,lncRNA在多种细胞的恶变过程中发挥着重要作用,在部分肿瘤中通过lncRNA-ANCR介导的EZH2影响肿瘤细胞的侵袭和转移。p21和p27均属于细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂家族,研究发现两者能够与各种细胞周期蛋白-细胞周期蛋白依赖激酶复合物相互识别并结合,从而起到抑制其生物学功能的作用,最终引起细胞周期停滞、阻断细胞增殖、诱导细胞凋亡。研究发现,当p21和p27表达发生异常下调时能够促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,抑制凋亡,因此两者具有抑癌基因的作用。目的本研究以临床以及体外细胞实验为基础,研究lncRNA-ANCR在骨肉瘤中的表达及其对骨肉瘤细胞生物学行为的影响,分析其中的相关作用机理,旨在为寻找新的骨肉瘤分子标志物以及药物作用靶点奠定基础。方法(1)自2015年12月至2016年6月间采集20例住院行手术治疗的骨肉瘤组织标本,同时采集20例接受腰椎间盘切除术的患者组织样本作为对照组。采用荧光定量PCR检测上述组织样本中LncRNA-ANCR的表达水平,分析其与骨肉瘤患者临床病理参数的相关性。(2)采用荧光定量PCR检测人骨肉瘤细胞系Hos、MG-63、SW1353、MC3T3-E1、UMR-106、U20S、SaoS2、143B 以及人成骨细胞系 HfoB1.19 中LncRNA-ANCR的表达,筛选出两株LncRNA-ANCR表达量最高的骨肉瘤细胞系用于后续实验研究。将筛选出的两种骨肉瘤细胞分为WT组、Mock组、NC组、siRNA组进行处理,采用荧光定量PCR检测上述各组细胞中LncRNA-ANCR的表达水平,采用CCK-8法检测各组细胞的增殖活性,流式细胞术检测细胞的凋亡情况,Transwell小室法检测细胞的侵袭能力,细胞划痕实验检测细胞的迁移能力。(3)将筛选出的两种骨肉瘤细胞分为WT组、Mock组、NC组、siRNA组进行处理,采用荧光定量PCR和Western blot法分别检测上述各组细胞中p21、p27、EZH2 mRNA和蛋白的表达。采用荧光定量PCR检测20例骨肉瘤组织和20例相应正常组织中EZH2 mRNA的表达。采用RNApull-down实验检测LncRNA-ANCR与EZH2间的相关性,并通过线性相关分析进行进一步验证。结果(1)①对骨肉瘤患者癌组织以及对照组患者无肿瘤组织中FOXM1 mRNA的表达情况进行分析,结果表明LncRNA-ANCR在骨肉瘤组织中的表达水平明显高于无肿瘤组织(P0.01)。②LncRNA-ANCR的表达与骨肉瘤患者的年龄、性别、肿瘤部位、病理分型无关(P0.05),而与骨肉瘤患者的Ennecking外科分期以及肿瘤转移有关,即LncRNA-ANCR在Ennecking分期较高的骨肉瘤患者中的表达水平明显高于Ennecking分期较低的患者(P0.05);在发生转移的骨肉瘤患者中的表达水平明显高于未发生转移的患者(P0.05)。(2)①与 HfoBl.19 细胞相比,Hos、MG-63、SW1353、UMR-106、U20S、SaoS2细胞中LncRNA-ANCR的表达水平明显增高(P0.05),其中MG-63和UMR-106细胞中LncRNA-ANCR的表达水平最高,因此选择这两种骨肉瘤细胞进行后续的实验研究。②在MG-63细胞中,与WT组相比,Mock组、NC组细胞中LncRNA-ANCR的表达水平无显著变化(P0.05);与WT组相比,siRNA组细胞中LncRNA-ANCR的表达水平明显减少(P0.05)。在UMR-106细胞中,与WT组相比,Mock组、NC组细胞中LncRNA-ANCR的表达水平无显著变化P0.05);与WT组相比,siRNA组细胞中LncRNA-ANCR的表达水平明显减少(P0.05)。③在MG-63细胞中,各组细胞在转染后各时间点的增殖率均呈逐渐上升趋势,与WT组相比,Mock组、NC组转染后第1、2、3、4天时细胞的增殖率无明显变化(P0.05);而与WT组相比,siRNA组细胞在转染后第2、3、4天时的增殖率均显著降低(P0.05)。在UMR-6细胞中,各组细胞在转染后各时间点的增殖率均呈逐渐上升趋势,与WT组相比,Mock组、NC组转染后第1、2、3、4天时细胞的增殖率无明显变化(P0.05);而与WT组,siRNA组细胞在转染后第2、3、4天时的增殖率均显著降低(P0.05)。④在MG-63细胞中,与WT组相比,Mock和NC组细胞的凋亡率无显著变化(P0.05);而与WT组相比,siRNA组细胞的凋亡率明显增高(P0.01)。在UMR-106细胞中,与WT组相比,Mock和NC组细胞的凋亡率无明显改变(P0.05);而与WT组相比,siRNA组细胞的凋亡率显著上升(P0.01)。⑤在MG-63细胞中,与WT组相比,Mock和NC组细胞的侵袭细胞数无显著变化(P0.05);而与WT组相比,siRNA组细胞的侵袭细胞数明显减少(P0.01)。在UMR-106细胞中,与WT组相比,Mock和NC组细胞的侵袭细胞数无明显改变(P0.05);而与WT组相比,siRNA组细胞的侵袭细胞数显著下降(P0.01)。⑥在MG-63细胞中,与WT组相比,Mock和NC组细胞的迁移距离无显著变化(P0.05);而与WT组相比相比,siRNA组细胞的迁移距离明显升高(P0.01)。在UMR-106细胞中,与WT组相比,Mock和NC组细胞的迁移距离无明显变化(P0.05);而与WT组相比相比,siRNA组细胞的迁移距离显著明显上升(P0.01)。(3)①在MG-63细胞中,与WT组相比,Mock组和NC组细胞中p21 mRNA的表达水平无明显变化(P0.05);与WT组相比,siRNA组细胞中p21 mRNA的表达水平明显增高(P0.05)。在UMR-106细胞中,相较于WT组,Mock组和NC组细胞中p21 mRNA的表达水平无明显变化(P0.05);而与WT组相比,siRNA组细胞中p21 mRNA的表达水平显著上升(P0.05)。②在MG-63细胞中,与WT组相比,Mock组和NC组细胞中p27 mRNA的表达水平无明显变化(P0.05);与WT组相比,siRNA组细胞中p27mRNA的表达水平明显增高(P0.05)。在UMR-106细胞中,相较于WT组,Mock组和NC组细胞中p27 mRNA的表达水平无明显变化(P0.05);而与WT组相比,siRNA组细胞中p27 mRNA的表达水平显著上升(P0.05)。③与WT组相比,Mock组和NC组细胞中p21和p27蛋白的表达水平无明显变化(P0.05);与WT组相比,siRNA组细胞中p21和p27蛋白的表达水平明显增高(P0.05)。④与正常组织相比,骨肉瘤组织中EZH2mRNA蛋白的表达水平显著升高(P0.05)。⑤lncRNA-ANCR和EZH2之间存在相互作用。从而提示LncRNA-ANCR可能对EZH2的表达存在影响。⑥线性相关系数分析结果显示,LncRNA-ANCR的表达与EZH2呈正相关(r2 = 0.7541,P0.0001)。结论(1)LncRNA-ANCR在大部分骨肉瘤组织中呈高表达状态,与骨肉瘤的Ennecking外科分期以及肿瘤转移有关。(2)LncRNA-ANCR能够促进骨肉瘤MG-63和UMR-106细胞增殖、侵袭和转移,抑制细胞凋亡。(3)LncRNA-ANCR通过抑制p21和p27的表达,促进EZH2的表达,从而推动骨肉瘤的恶性化进程。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R738.1

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