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《武汉大学》 2017年
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程序性坏死在急性病毒性心肌炎的作用机制研究

周飞  
【摘要】:目前的临床和基础研究表明,促使病毒性心肌炎(virus myocarditis,VMC)特别是急性重症病毒性心肌炎发病的机制主要是反复的病毒感染和慢性的免疫损伤导致对心肌组织的持续损害,主要表现为一系列分子生物学事件的发生,包括受损心肌细胞的变性坏死、炎性细胞的浸润、心肌及心肌间质细胞的纤维化等,最终的结果是导致心室重构和血流动力学的改变,出现心力衰竭而无法逆转其过程。心肌细胞的坏死是推动该过程不断进展的核心动力,但心肌损伤作为整个过程中的始动机制并未完全明确,因此,探讨早期心肌细胞坏死的确切分子机制、鉴定心肌细胞损伤的分子靶点具有重大临床意义。程序性坏死(Necroptosis)是一种可调控性的细胞坏死,主要通过死亡受体和配基启动,受体交互作用蛋白(receptor interacting proteins,RIPs)活化介导,启动各种下游信号通路的转导而实现。RIPs因其能启动和调控细胞对外来刺激的应激反应,因此细胞在体内不同命运的走向包括凋亡、坏死或存活主要由RIPs所决定。在众多RIPs分子中,RIP1和RIP3在程序性坏死信号通路的调控中起到关键作用。程序性坏死的特点包括,具有典型的坏死样形态学改变,其特异性的RIP1激酶抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)能抑制其过程,凋亡和自噬的特异性抑制剂zVAD-fm和3-MA不能阻断此过程,从而减少炎症细胞浸润和激活。程序性坏死作为一种可以调控的新的细胞死亡方式,在急性心肌梗死、缺血再灌注损伤、感染性休克等众多急危重症疾病中发挥着重要作用。细胞的坏死与否在病毒性心肌炎的发生发展过程中起到重要作用,并且心肌细胞的坏死是急性病毒性心肌炎的主要病理学形态,但目前国内外关于细胞坏死方式特别是程序性坏死与病毒性心肌炎心肌损伤之间的研究处于起步阶段,因此本研究拟通过建立柯萨奇病毒B3(coxsaekievirus B3,CVB3)感染的急性重症病毒性心肌炎小鼠模型,采用一系列研究方法包括Western blot、组织免疫化学、光镜电镜等实验技术从细胞到整体水平探讨程序性坏死在急性重症病毒性心肌炎中的作用机制,从而阐明病毒性心肌炎心肌细胞损伤的主要方式及机制,从坏死可控与否的角度为其防治及进展提供新的理论基础和临床治疗的靶点。第一部分目的利用CVB3病毒感染BALB/c小鼠构建急性重症病毒性心肌炎小鼠模型。方法根据GayR.T.等的方法,确定动物造模实验中CVB3病毒的接种量为1000 TCID50 0.1ml;取20只4周龄雄性BALB/c小鼠,随机数字法分组为每组10只,模型组腹腔内无菌接种0.1ml CVB3病毒制作急性重症病毒性心肌炎动物模型,对照组小鼠以同样方法接种等体积生理盐水;以上小鼠腹腔注射药物治疗连续7天,每天一次按Karder法计算TCID50。结果在正常组小鼠100%存活且各项生理指标正常。同期CVB3病毒接种感染组:第4天开始出现死亡,至第7天死亡率为50%,符合急性重症病毒性心肌炎的生存率表现;在CVB3病毒接种感染第7天,CVB3组小鼠血清CK、CK-MB、cTnl的水平与正常小鼠相比显著升高(P0.01),该结果提示心肌细胞受损严重;通过显微镜观察死亡小鼠心肌细胞形态发现CVB3感染小鼠心肌细胞胞核和轮廓消失,坏死后周围出现大量炎症细胞浸润;进一步电镜观察发现:CVB3感染组线粒体肿胀,内有许多空泡形成。结论成功构建了 CVB3病毒感染介导的BALB/c小鼠急性重症病毒性心肌炎模型,该模型动物急性心肌炎病程进展迅速,死亡率高,心肌局部炎症反应重。该模型为本研究探索急性重症病毒性心肌炎细胞死亡机制及其潜在分子靶点奠定了基础。第二部分目的观察和研究介导程序性坏死的关键蛋白RIP1/RIP3坏死体在CVB3病毒诱导的急性重症病毒性心肌炎小鼠受损心肌细胞中的表达及其意义。方法60只4周龄雄性BALB/c小鼠,随机对照法分为:正常对照组(10只)、CVB3感染组(20只)、药物治疗组(20只)以及空白对照组(10只)。正常对照组小鼠每只腹腔注射生理盐水0.1ml;CVB3感染组小鼠每只腹腔注射CVB3病毒0.lml;药物治疗组每只除腹腔注射CVB3病毒0.lml,4小时后,尾静脉注射不同的药物(Z-VAD-fmk,lmg/kg;3-MA,15mg/kg;Nec-10.6mg/kg;药物溶于0.1%DMSO),空白组小鼠无任何处理;以上小鼠均连续7天行腹腔注射药物治疗,每天一次。采用Western blot和组织免疫化学法检测程序性坏死的关键蛋白RIP1/RIP3、下游通路蛋白MLKL、PGAM5L;凋亡的关键蛋白Caspase-3以及自噬的关键蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3-II)的表达。结果与正常组相比,Western blot结果显示,CVB3病毒感染组小鼠心肌细胞RIP1/RIP3、MLKL、PGAM5L 蛋白表达明显增高(P0.01),使用 Nec-1 后,MLKL、PGAM5L蛋白表达明显降低(P0.01);CVB3病毒感染组早期(第四天)心肌组织的LC3-II、Caspase-3、RIP1/RIP3蛋白表达均有所增高(P0.05,T检验),但是感染后第7天仅有LC3-II、RIP1/RIP3增高显著(P0.01,T检验),应用Nec-I后LC3-II蛋白表达明显减少(P0.01)。免疫组化也显示,CVB3病毒感染组心肌细胞RIP1/RIP3的蛋白表达显著增强,且在心肌细胞内呈弥漫分布。结论RIP1/RIP3坏死体在CVB3诱导的急性重症病毒性心肌炎小鼠中心肌损伤发生发展过程中起到重要作用,其下游信号转导可能是通过RIP1-RIP3-MLKL-PGAM5L通路而实现。Nec-1导致心肌细胞内LC3-II的表达水平显著下降这一现象说明心肌细胞的自噬可能是RIP1/RIP3介导程序性坏死的下游反应,VMC心肌组织自噬体形成可能是由程序性坏死引起,从而证明程序性坏死是细胞程序性死亡的主要方式。第三部分目的探讨程序性坏死特异性抑制剂Nec-1对CVB3病毒诱导的急性重症病毒性心肌炎心肌损伤的保护作用方法取60只4周龄雄性BALB/c小鼠,分为正常对照组(10只),CVB3病毒感染组(20只),CVB3+Nec-1组(20只),空白对照组(10只)。模型组的制作方法是腹腔内无菌接种0.lml CVB3病毒制作急性重症病毒性心肌炎动物模型;正常对照组小鼠每只腹腔注射生理盐水0.1ml;CVB3病毒感染组小鼠每只腹腔注射CVB3病毒0.lml,每天一次;CVB3+Nec-1组每只除腹腔注射CVB3病毒0.1ml,4小时后,尾静脉注射药物(Nec-10.6mg/kg;以上药物均溶于0.1%DMSO),空白组小鼠无任何处理;以上小鼠均连续7天行腹腔注射药物治疗。7天后检测小鼠体重指数、存活率、血清CK、CK-MB、cTnl水平、心脏组织HE染色、电镜观察心肌组织的病理学变化,采用心脏超声技术测定左室心功能等指标评估病毒性心肌炎的诱导及其程度。结果与CVB3病毒感染组相比,CVB3+Nec-1组从第五天开始存活率增加,达到90%并保持稳定状态;体重指数从第二天开始上升,并保持稳定状态;CVB3+Nec-1组 CK、CK-MB 及 cTnl 均显著下降(P0.01);CVB3+Nec-1 组 RIP1 和 RIP3蛋白水平显著降低(P0.01);免疫组化显示,CVB3+Nec-1组RIPI和RIP3的阳性着色显著减轻。组织病理形态学显示,CVB3+Nec-1组小鼠的心肌病变程度明显减轻,表现出显著的心肌保护作用。电镜下观察,CVB3+Nec-1组肌原纤维排列整齐,无明显溶解坏死,线粒体肿胀空泡减少,心肌病变减轻;心脏超声结果显示,应用Nec-1后心脏EF值和LVDESD明显改善(P0.01)。结论Nec-1对CVB3病毒介导的急性重症病毒性心肌炎小鼠的心肌细胞具有明显的保护作用,可能是通过抑制RIP1/RIP3坏死体的形成而实现。综上所述,本课题研究表明三种程序性死亡方式均参与了急性重症病毒性心肌炎心肌细胞损伤的死亡过程,但程序性坏死是心肌细胞程序性死亡的主要方式。这也说明急性重症病毒性心肌炎时心肌细胞的坏死是程序性、可调控的过程。而程序性坏死的特异性抑制剂Nec-1对CVB3病毒介导的急性重症病毒性心肌炎小鼠的心肌细胞具有明显的保护作用,提示抑制程序性坏死很有可能对急性重症病毒性心肌炎的治疗产生重大的临床意义。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R542.21

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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