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《武汉大学》 2015年
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基于单细胞技术研究口蹄疫病毒感染和宿主细胞EBP基因的关系

方卉  
【摘要】:口蹄疫病毒属于小RNA病毒科的成员,其感染存在两种形式,即急性感染和持续性感染。自然条件下,口蹄疫病毒既可以引起偶蹄类动物急性感染,也可以低毒的形式于动物体内产生持续性感染。在离体细胞培养的实验条件下,口蹄疫病毒急性感染导致宿主细胞病变(CPE)死亡。通过改变病毒感染条件和感染后存活细胞的筛选,也可以在实验条件下获得持续性感染口蹄疫病毒的细胞株。病毒持续性感染细胞株的建立有利于深入研究病毒和宿主细胞之间的关系。本实验室先前的研究显示口蹄疫病毒急性感染BHK-21细胞引起细胞EBP基因表达上调,而形成持续性感染后,细胞EBP基因表达则下调。EBP(emopamil binding protein)蛋白是一种固醇异构酶(sterol isomerase),广泛存在于哺乳动物细胞中。对该基因在口蹄疫病毒急性感染细胞和持续感染细胞两种模型中不同变化情况的研究,有助于我们了解急性感染与持续感染不同的形成机制,以及EBP基因在这两种不同感染模型中所发挥的作用。本研究挑取了 PI28、PI38、PI55和PI68 4个代次的318个口蹄疫病毒持续性感染单细胞,应用单细胞技术研究单个细胞的基因转录组学,深入探讨口蹄疫病毒持续感染BHK-21细胞中EBP基因表达的变化趋势,从而揭示病毒感染引起胞内基因表达随机性和细胞异质性的机制。研究结果如下:1)口蹄疫病毒在以20000 pfu急性感染BHK-21细胞8 h.p.i后,EBP基因表达上调至正常细胞的1.36倍,EBP基因表达量上调的单细胞比例占总细胞的11.9%,约为4 h.p.i时的两倍。病毒急性感染BHK-21细胞在4 h.p.i时,感染阳性率已达90%,在8 h.p.i时达到100%。在从4 h.p.i到8 h.p.i短短四个小时的时间里,病毒量增加了 4个数量级。2)在BHK-21细胞中过表达EBP基因后感染口蹄疫病毒,病毒的复制水平是对照细胞中的2.3倍,说明EBP基因的上调可以在一定程度上促进口蹄疫病毒的复制。3)检测了 318个口蹄疫病毒持续性感染单细胞的3D基因(口蹄疫病毒基因)和EBP基因的表达情况,发现在病毒持续感染的不同传代时期,病毒3D基因的表达与宿主EBP基因的表达之间存在动态变化。4)持感PI28代次,携带病毒的单细胞比例偏低(仅为66.7%),口蹄疫病毒处于从急性感染向持续性感染过度的阶段,此代次细胞中EBP基因的表达量为持感所有代次中最高,且也高于正常BHK-21细胞的单细胞均值。其上调细胞比例高达62.9%,单个细胞中拷贝数最高可达到982copies/cell,为正常细胞均值的1.24 倍。5)持感PI38代次,宿主EBP基因的表达逐渐降低,表达量低于正常细胞均值的细胞占总数的78.2%。携带病毒的单细胞比例增多(占总数的98.7%),单细胞中病毒3D基因表达量达到所有代次的峰值,有66.7%的细胞3D基因的表达量高于PI28代次单细胞的均值,单个细胞中3D基因的含量最高达17576 copies/cell,是PI28代次单细胞均值的3.8倍。6)持感PI55和PI68代次,携带病毒的单细胞比例分别为100%和95.8%,已趋于平衡,形成稳定的病毒持续感染状态。且宿主EBP基因的表达急速降低,在PI68代次时降至最低值,下调细胞比例为95.6%,平均表达量仅为正常BHK-21细胞表达量的四分之一。口蹄疫病毒3D基因的表达量也在PI68代次时降至最低值,与PI28代次3D基因表达量均值相比,下调的细胞比例为91.2%,并且EBP基因和3D基因同时上调的细胞比例降至为0。本研究从单细胞的角度对口蹄疫病毒持续感染BHK-21细胞中EBP基因与病毒3D基因在持续感染不同代次中的变化趋势进行研究,结果表明这种方法能够反映每个细胞的真实情况,能观察到被群体数据平均化所掩盖的现象,更精确的揭示病毒感染后细胞胞内基因表达随机性和细胞异质性的现象。单细胞的研究结果提示,口蹄疫病毒持续性感染细胞的建立是一个动态变化的过程,是病毒与宿主细胞相互适应、共同进化并最终达到平衡的结果。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S852.65

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