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《武汉大学》 2017年
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靶向急性T淋巴细胞白血病中CK2和NOTCH1/MYC信号通路的研究

连海伟  
【摘要】:研究背景:急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)是起源于未成熟胸腺细胞的恶性肿瘤。虽然目前治疗水平已有很大的提高,但是T-ALL在20%的儿童和50%的成人患者中仍然是致命的疾病。而且化疗中,多种细胞毒性药物的反复使用常导致高毒性反应和抗药性,强烈需要发展新的靶向治疗方案。半数以上的T-ALL患者因携带NOTCHl功能获得性突变而异常激活NOTCHl信号通路。在过去的10余年里,通过γ-分泌酶抑制剂(GSI)抑制T-ALL细胞中异常的NOTCH1信号传导通路的研究取得很大进展。然而,GSI的胃肠道毒性和耐药性限制了其临床应用。NOTCH1的转录靶标之一是原癌基因MYC。MYC是T-ALL疾病发生的主要始动因素。通过BET溴结构域抑制剂JQ1靶向阻断MYC介导的转录过程已在体外和体内实验中表现出抗白血病的功效。但是全盘抑制MYC介导的转录会导致药物毒性。我们寻求能与JQ1协同作用杀死T-ALL细胞的其他药物,希望可以提高疗效,同时降低毒性。NOTCH1可以被蛋白激酶CK2磷酸化而激活。CK2是由两种催化(α或α')和一种调节(β)亚基组成的四聚体型丝氨酸-苏氨酸激酶。CK2在多种实体和血液肿瘤中高表达,CK2活性及其蛋白水平在原代T-ALL细胞中升高。CK2的特异性抑制剂CX-4945已进入治疗乳腺癌和多发性骨髓瘤的临床试验。研究发现,CX-4945能显著降低人T-ALL细胞的生长和存活,并下调肺癌细胞中的NOTCH1。但是CX-4945对T-ALL细胞的作用机制尚不清楚。研究目的:本研究着重探讨T-ALL疾病中CK2对NOTCH1信号通路的调节作用,阐明T-ALL中CK2与NOTCH1/MYC信号通路的分子联系;探讨联合使用CK2抑制剂和NOTCH1通路抑制剂的药物组合效果,开辟新的治疗T-ALL疾病的策略。研究方法:首先我们从公开的数据库获取数据,运用生物统计学方法分析T细胞发育各阶段及不同类型T-ALL中CK2各个亚基基因的表达水平。使用蛋白免疫印迹(Western Blot)技术检测T-ALL细胞系和人原代T-ALL样本中的CK2及NOTCH1信号通路相关蛋白的表达。Cleaved-PARP(一种凋亡标记蛋白)和代表CK2活性的蛋白质水平(磷酸化AKT S129)亦通过Western Blot检测。用靶向CK2α的shRNA干扰技术沉默JURKAT细胞(过表达BCL-2)中的CK2α,并用蛋白免疫印迹法确定CK2α shRNA的抑制效果。用脉冲示踪方法分析T-ALL细胞给予遗传学和药理学抑制CK2后cleaved-NOTCHl(活化的NOTCH1受体蛋白)半衰期的变化。用荧光实时定量PCR检测CX-4945处理后T-ALL细胞中MYC转录水平的改变。用CellTiter-Blue(?)细胞活力测定检测T-ALL细胞的活力。用流式细胞仪分析检测细胞凋亡和细胞周期分布情况。制备小鼠异种移植模型以培养和获取人原代急性T淋巴细胞白血病细胞。研究结果:与正常胸腺组织和发育中的T细胞比较,T-ALL中蛋白激酶CK2表达水平增高;人原发T-ALL细胞中NOTCH1通路的cleaved-NOTCH1和MYC蛋白水平上调,且与CK2蛋白表达增高呈正相关性;CK2抑制剂CX-4945抑制CK2酶活性,下调cleaved-NOTCHl及MYC蛋白和c-MYC基因的转录水平;抑制CK2降低NOTCH1蛋白的稳定性使NOTCH1信号通路失活。CX-4945与JQ1协同作用降低T-ALL细胞活力,并且最小程度地影响正常血细胞;CX-4945与JQ1协同作用诱导T-ALL细胞凋亡增加,而不影响细胞周期分布。结论和意义:我们的研究表明,CK2抑制剂CX-4945能使NOTCH1不稳定,并与JQ1协同作用降低人T-ALL细胞活性。在CK2,NOTCH1和MYC高表达的T-ALL细胞中,CX-4945与JQ1显示出显著的协同作用。我们的数据提示高表达CK2的人T-ALL细胞比低表达CK2的T-ALL对这两种药物联合治疗会更敏感。对于难治性/复发性T-ALL患者CX-4945与JQ1的联合用药可提供一个更好的靶向NOTCH1信号通路的治疗方案。我们的研究结果为在难治性/复发性T-ALL的临床前在体模型中检测CX-4945和JQ1的组合用药提供了理论依据。鉴于CK2和NOTCH1/MYC在癌症中的广泛参与,CX-4945和JQ1的组合用药在其他肿瘤类型中的效果值得进一步研究。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R733.7

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