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《武汉大学》 2018年
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基于磁性微球的信号放大/化学发光检测核酸和蛋白质

李宁星  
【摘要】:核酸和蛋白在生命体中起着重要作用,所以,建立检测核酸和蛋白的高灵敏方法具有重要意义。化学发光分析由于其灵敏度高和线性范围宽等优点,常常作为核酸和蛋白的检测手段。但对于某些超低含量的检测,有时也显得有些无力,因此,需要结合信号放大技术。传统的信号放大技术存在一些缺点,例如需要反复退火和加酶等。此外,均相体系的检测容易受到复杂环境的干扰,出现背景过高,甚至假阳性等情况。针对以上问题,我们将不需要反复退火、操作简便的恒温信号放大技术,如双发卡核酸催化组装技术(Catalytic hairpin assembly,CHA)、恒温链置换聚合反应(Isothermal strand-displacement polymerase reaction,ISDPS)以及杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)等与磁分离和化学发光检测结合。建立了几种灵敏度高、选择性好的检测核酸和蛋白的化学发光分析新方法,具体工作如下:1.在磁性微球表面,构建了两种基于CHA的DNA步行者传感器,其中一种是单脚DNA步行者,另一种则是双脚的;它们基本原理相似。当目标DNA存在时,打开磁性微球上发卡结构的核酸,并诱导双发卡核酸自组装,发生链置换反应,将目标DNA释放出来,这样目标DNA就能不断在磁性微球表面行走,起到信号放大作用。在最优的实验条件下对两者的检出限进行对比,发现单脚DNA步行者传感器比双脚的灵敏度更高,于是,初步探究了可能的原因。此外,将HIV核酸序列当作目标序列进行了研究。鉴于单脚DNA步行者传感器具有较高灵敏度,最后将它应用到T4磷酸激酶活性的检测中,获得了满意的结果。2.为了探究DNA步行者传感器在蛋白检测方面的应用,以链霉亲和素为检测对象,构建了一种基于CHA的多脚DNA步行者传感器。当链霉亲和素存在时,3'端修饰了生物素的DNA单链与之结合,形成多脚DNA步行者。在蛋白末端保护的作用下,外切酶I无法剪切DNA单链,多脚DNA步行者被保留下来。DNA步行者的“脚”可以打开磁性微球上修饰的发卡结构核酸,诱导双发卡核酸自组装,自身则被置换下来,不断在磁性微球表面行走,起到循环放大作用。由于基于CHA的DNA步行者传感器背景较高。为了解决这一问题,设计构建了基于ISDPR的多脚DNA步行者传感器。和CHA法的不同之处在于,ISDPR是依靠一段很短的引物核酸序列在聚合酶作用下进行延伸,以置换下多脚DNA步行者,成功降低了背景信号。3.由于基于ISDPR的DNA步行者背景较低,以它为基础,构建了双脚DNA步行者,使其行走在设置有障碍物的轨道上,并研究它的一系列行走行为。我们将磁性微球上偶联的产生位阻效应的DNA单链称之为“位阻链”。当磁性微球上偶联了位阻链时,由于空间位阻效应,DNA步行者的移动过程会收到一定程度的影响,行进速率发生改变。通过改变磁性微球上偶联的位阻链的长度、构型和数量等,成功调控了双脚DNA步行者的移动速率。研究发现,在一定的反应时间内,偶联了长度适当的位阻链的磁性微球,能使信噪比有所提升,这一结果对于提高检测灵敏度具有着重要意义。最后,为了拓展其应用,将双脚DNA步行者传感器成功应用于核酸检测中。4.为了进一步提高检测灵敏度,构建了一种基于HCR的高灵敏化学发光成像检测法,并将其应用于凝血酶检测。我们在磁性微球表面偶联凝血酶的适配体,引物DNA链的一端可以与之部分杂交,而另一端则能够引发两个发卡结构发生HCR,起到信号放大作用。当凝血酶存在时,它与磁性微球上偶联的适配体结合,这样杂交链式反应的产物会脱离磁性微球。通过检测上清液中催化反应产生的化学发光,从而测定凝血酶的含量。该方法检出限达9.7 fM。但由于该方法抗干扰能力弱,我们对模型进行了改进。通过改变引物DNA链和加样顺序,使凝血酶能与磁性微球上适配体和引物上的适配体形成三明治夹心结构,之后再引发HCR,最终,杂交链式反应的产物在磁性微球上,能够有效避免杂质干扰,实际应用价值更好。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:O657.3

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