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《武汉大学》 2018年
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DNA功能化硅点用于荧光检测及细胞成像

张亚楠  
【摘要】:细胞成像能够提供细胞内生物分子的空间分布情况,对了解细胞的生理学过程至关重要。细胞成像与荧光检测有效结合,可以提供更加丰富的信息。DNA因其生物兼容性、水溶性、可调控性、靶向性等诸多生物学功能,而被广泛用于荧光生物探针的构建。DNA功能化纳米荧光探针集纳米材料和DNA的特性于一体,成为荧光检测和成像分析的有力工具。但常用的DNA功能化纳米荧光探针多为单发射探针,易受细胞摄入量、探针浓度、光程长度等因素的影响,造成荧光信号波动。而双发射比率荧光探针可以克服以上缺陷。因此,构建新型DNA功能化纳米荧光比率探针并将其应用于生化检测与成像分析具有重要的意义。本论文作者制备了 DNA功能化硅点荧光探针,并将其用于核酸、蛋白、金属离子及氢离子检测,并用所构建的双发射比率荧光探针,分别实现了细胞双色荧光成像分析、细胞靶向识别及亚细胞器—溶酶体的双色荧光成像分析。主要研究内容如下:(1)建立了检测疾病相关微小核糖核酸miRNA-27a的新方法。基于硅点(SiND)对花青染料Cy5标记的单链DNA(Cy5-DNA)的荧光猝灭效应及静电相互作用,制备了 Cy5-DNA/硅点探针。该探针与人工合成的miRNA-27a(S-miRNA-27a)互补杂交后,Cy5-DNA的荧光可以恢复。本方法采用T碱基替换U碱基的S-miRNA-27a作为目标物,可避免使用潜在致癌试剂焦碳酸二乙酯(DEPC)和生物酶,提高了体系的稳定性。在最优的实验条件下,该方法的线性范围为0.5-20 nM,检出限为0.16nM,相对标准偏差为9%(c=1nM,n = 5)。将所建立的方法应用于人尿样和血清中S-miRNA-27a目标物的分析,加标回收率为90%-122%,获得满意结果。(2)采用共价偶联法,构建了 6-羧基-X-罗丹明(Rox)标记的DNA功能化SiND比率荧光探针,基于T-Hg2+-T作用,建立了检测人宫颈癌细胞HeLa中Hg2+的比率荧光方法。当存在Hg2+时,DNA可形成发夹结构,拉近了探针中Rox和SiND的距离,使Rox的荧光被SiND猝灭。紫外-可见光谱、荧光寿命等结果进一步表明,该比率荧光探针的信号变化仅与Hg2+有关。因此,用Rox的荧光作为响应信号,SiND的荧光作为参比信号,建立了比率荧光检测Hg2+的方法。在最优的实验条件下,该方法的线性范围为10-1500 nM,检出限为9.2 nM,相对标准偏差为8.8%(c=50nM,n=7)。将方法应用于人尿样和血清中Hg2+的分析,加标回收率为81-107%。通过DNA共价修饰硅点,既提高了硅点的耐酸碱性,也利于其在细胞中应用,实现了 HeLa细胞中Hg2+的可视化成像分析。(3)建立了检测肿瘤标志物粘蛋白MUC1以及癌细胞的双色荧光成像方法。通过将Cy5标记的MUC1的适配体S2.2共价偶联到SiND上,制备了选择性响应MUC1的比率荧光适配体探针(SiND-S2.2-Cy5)。当体系中不存在MUC1时,探针中Cy5的荧光可以被SiND猝灭;当存在MUC1时,S2.2与MUC1之间的作用能够引起适配体结构的变化,从而使荧光恢复。在最优的实验条件下,线性范围为3.33-250nM,相对标准偏差为3.6%(c=10nM,n=7),检出限为1.52nM,实现了人血清中MUC1的检测,加标回收率为87-108%。所构建的比率荧光探针可有效区分MUC1-阳性的人乳腺癌细胞MCF-7和MUC1-阴性的人乳腺正常细胞MCF-10A、非洲绿猴肾细胞Vero,实现了癌细胞和正常细胞的识别。(4)构建了一种亚细胞器氢离子检测的DNA适配体功能化SiNDL比率荧光探针。将荧光素FAM标记的核仁蛋白的适配体AS1411共价偶联到SiND上,通过优化SiND用量和适配体链长,构建了最佳信号比值的pH比率荧光探针(SiND-Apt-FAM)。将同步荧光扫描法、荧光成像和流式细胞术相结合,研究了所构建的荧光探针在细胞溶酶体中的应用。与正常细胞MCF-10A相比,该荧光探针可识别过表达核仁蛋白的MCF-7细胞和HeLa细胞,并有较宽的pH响应范围(pH 4.5-8.0)。所构建的探针能够实现MCF-7细胞溶酶体的双色荧光成像及其氢离子的检测(pH 5.1)。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:O657.3

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