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《武汉大学》 2018年
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酸敏感离子通道3在癫痫发作中的作用及机制研究

曹倩  
【摘要】:背景(1)癫痫是一种常见的可致残的脑部疾病,由多种原因导致中枢神经系统神经元高度同步化异常放电所致,以反复发作的痫性发作为特点。目前全球癫痫患者数量达5000万之多,其中约20-30%患者发展为耐药性癫痫,需要终生药物治疗,且对药物疗效反应不佳,这给患者的身心健康、工作生活等一系列方面带来严重影响,因次,癫痫已成为全社会关注的公共卫生问题,迫切需要对其发作、发生、发展机制以及在此基础上挖掘出的干预靶点进行研究。(2)癫痫发作过程伴有组织酸化,酸敏感离子通道(acid sensing ion channels,ASICs)是一种配体门控离子通道,当细胞外氢离子浓度升高时激活开放,所以该通道在癫痫发作中扮演了一定角色。但目前对酸敏感离子通道在癫痫发作中的作用尚不明确,有诸多争议,特别是关于该通道是促癫痫发作还是抗癫痫发作,多方证据各执一词。酸敏感离子通道3(acid sensing ion channel 3,ASIC3)是该通道的亚基之一,它对酸性刺激最为敏感,开放过程中表现为双相电流,亚基失活速度慢,保持开放时间长,因此最有可能对癫痫发作进行调控。目前,该亚基在癫痫发作方面的研究较少,值得深入挖掘。目的(1)本研究旨在探讨癫痫发作动物模型和癫痫发作细胞模型中ASIC3的表达变化。(2)通过研究ASIC3对癫痫发作动物行为学的影响及相关的分子机制,为抗癫痫发作药物研发提供新的思路和理论依据。方法(1)ASIC3在癫痫发作动物中的表达:采用氯化锂-匹罗卡品癫痫发作大鼠模型,用蛋白印迹检测不同时间点动物海马区ASIC3的蛋白表达变化;用RT-PCR技术检测不同时间点动物海马区ASIC3的mRNA转录水平变化;用免疫组织化学检测动物海马区ASIC3的免疫染色强度。(2)ASIC3在癫痫发作细胞模型中的表达:培养新生大鼠海马原代神经元,采用免疫荧光染色鉴定纯度;用无镁外液诱导神经元癫痫样放电,并用膜片钳技术予以证实;用蛋白印迹检测神经元癫痫样放电后ASIC3的表达变化。(3)ASIC3对癫痫发作动物行为学的影响:采用氯化锂-匹罗卡品癫痫发作大鼠模型,用ASIC3特异性阻断剂APETx2进行侧脑室注射,采用Racine评分评价动物癫痫发作潜伏期、最大发作强度、全身强直阵挛发作(Generalized tonic-clonic seizures,GTCS)比例以及发作强度随时间的变化曲线。(4)ASIC3对癫痫发作影响的机制研究:在癫痫发作大鼠模型中,采用蛋白印迹检测ASIC3 抑制后对 NMDA 受体(N-methyl-D-aspartate receptors,NMDARs)、AMPA受体(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors,AMPARs)各亚基表达的影响;用免疫共沉淀检测ASIC3和NMDA受体、AMPA受体的相互作用;用蛋白印迹检测NMDA受体下游信号通路钙调蛋白依赖的蛋白激酶(calmodulin-dependent protein kinase-Ⅱ,CaMKⅡ)和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)的变化情况;用膜片钳检测在无镁外液诱导的癫痫发作细胞模型中ASIC3抑制后神经元自发和诱发动作电位发放的变化,用膜片钳检测ASIC3抑制后海马脑片中NMDA受体介导的微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynapticcurrent,mEPSC)和诱发兴奋性突触后电流(evoked excitatory postsynaptic current,eEPSC)的变化。结果(1)蛋白印迹检测显示,正常大鼠海马组织有ASIC3的本底表达,癫痫发作2小时后表达水平即开始增高,24小时显著升高,48小时到达平台期,72小时略有降低;RT-PCR显示,正常大鼠海马组织有ASIC3的mRNA本底表达,随着癫痫发作后时间推移,ASIC3的mRNA转录水平显著增加;免疫组织化学显示,正常大鼠海马区ASIC3的免疫反应强度较弱,癫痫发作24小时后,免疫反应强度显著升高。(2)原代培养海马神经元经过MAP-2免疫荧光染色鉴定纯度较高;培养12-14天后,在电流钳模式I = 0条件下进行全细胞模式记录显示,正常组海马神经元可见偶发的自发动作电位发放,而无镁外液诱导3小时组可见密集的动作电位发放;无镁外液诱导组神经元ASIC3蛋白表达水平较正常组显著升高。(3)侧脑室注射ASIC3的抑制剂APETx2后,大鼠癫痫发作潜伏期显著缩短,癫痫发作最大强度显著增加,全身强直阵挛发作发生率显著增加,在匹罗卡品注射后15分钟、30分钟、60分钟时间点癫痫发作强度显著高于假手术组,45分钟时间点癫痫发作强度无显著差异。(4)侧脑室注射ASIC3的抑制剂APETx2后,大鼠癫痫发作后NMDA受体NR1、NR2A、NR2B亚基膜蛋白表达升高,而AMPA受体亚基GluR1膜蛋白表达未见明显改变;ASIC3和NR1、NR2A、NR2B亚基之间存在蛋白相互作用,但和AMPA受体的GluR1亚基没有相互作用;APETx2预处理显著增加了大鼠癫痫发作后磷酸化CaMKⅡα蛋白和磷酸化CREB蛋白表达水平;AP5抑制NMDA受体功能后反转了APETx2预处理引发的癫痫发作程度加剧。无镁外液诱导的海马神经元经过APETx2处理后自发动作电位和诱发动作电位发放数均增加;经过APETx2预处理的癫痫发作大鼠脑片中NMDA受体介导的微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic current,mEPSC)频率和幅度增加,NMDA 受体介导的诱发兴奋性突触后电流(evoked excitatory postsynaptic current,eEPSC)也增加。结论(1)ASIC3在大鼠氯化锂-匹罗卡品癫痫发作模型和无镁外液诱导原代海马神经元癫痫样放电模型中均表达升高。(2)抑制ASIC3加剧了氯化锂-匹罗卡品癫痫发作模型中大鼠癫痫发作严重度,增加了无镁外液中原代海马神经元兴奋性。(3)抑制ASIC3加剧动物癫痫发作严重度与NMDA受体上调、NMDA受体下游CaMKⅡ和CREB信号通路激活以及突触传递中NMDA受体介导的mEPSC和eEPSC增加相关。(4)ASIC3是机体自身抗癫痫发作的内源性保护机制,加强ASIC3的功能可能成为防治癫痫发作的新途径。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R742.1

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