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《武汉大学》 2018年
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珍宝丸在脊髓损伤再生修复中的作用及相关机制研究

郇颜强  
【摘要】:背景脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是临床常见疾患,致残率高,远期缺乏有效治疗的药物。本课题基于多年珍宝丸临床治疗经验及前期实验研究发现,含珍珠层,蟾蜍,麝香,羚羊的珍宝丸对脊髓损伤(SCI)有良好的治疗作用。然而,其修复脊髓损伤的复杂机制尚不清楚,脊髓损伤中各种复杂的分子机制还不是十分明确,还需要进一步的探讨及研究,本文从珍宝丸入手,使用脊髓损伤的大鼠模型进行研究,以期得到珍宝丸在脊髓损伤再生修复中的作用和相关机制。第一部分珍宝丸通过上调HSP27减少Treg细胞缓解大鼠脊髓损伤目的本研究旨在探讨CD4 + CD25 + Foxp3 +调节性T细胞(Tregs)在珍宝丸修复脊髓损伤作用机制中的作用,进一步探讨Tregs与HSP27在修复机制中的关系。方法用珍宝丸不同浓度(0,0.5,2.5,5,10mg/mL)处理人外周血单个核细胞(PBMCs),流式细胞仪检测Tregs中特异性因子CD4 + CD25 + Foxp3 +的表达,用ELISA测定检测Tregs相关调节因子TGF-β含量。荧光素酶法检测miR-214与HSP27的关系,qR-PCR法检测miR-214的表达水平。qPCR和Western blotting检测HSP27的表达。采用RNA干扰技术和基因重组技术抑制和上调HSP27的表达。结果珍宝丸对Tregs的IC50为11.61mg/mL,可显着抑制人PBMCs分化成Tregs,并上调超过1倍的HSP27表达。基本上,它通过抑制miR-214表达(50%)来增强HSP27的表达。在人PBMCs中促进了 HSP27表达的抑制,随后分化成Tregs。当HSP27表达上调时,向Tregs的分化减少30%。这表明HSP27的表达调节了向Tregs的分化。抑制HSP27表达和珍宝丸治疗后,分化成Tregs的比例下降,但仍高于仅用药治疗组。在珍宝丸的作用下,HSP27的表达没有完全干扰,其表达水平仍然增加。结论在脊髓损伤再生修复的过程中,珍宝丸通过诱导HSP27表达来抑制Treg细胞数量和降低TGF-β的水平。第二部分珍宝丸通过调节GPR17表达的miR-146a-5p防止急性脊髓损伤目的本研究旨在观察珍宝丸对急性脊髓损伤(ASCI)大鼠运动功能的影响,以及miR-146a-5p和G蛋白偶联受体17(GPR17)的分子机制。方法用Allen's法建立急性脊髓损伤的大鼠模型,将大鼠分为3组。将SH-SY5Y细胞在低氧条件下培养过夜并用miR-146a-5p模拟物或miR-146a-5p抑制剂转染。用(Basso,Beattie,Bresnahan,BBB)评分系统评估大鼠的后肢运动功能。实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)和 Western blot 检测 miR-146a-5p,GPR17,诱导型一氧化氮合酶(iNOS),白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。使用低细胞计数测定法测量神经元凋亡。进行萤光素酶报告基因测定以确定miR-146a-5p 对 GPR17 的调节。结果珍宝丸可增加miR-146a-5p的表达水平,降低GPR17的表达,生物信息学软件预测GPR17 3'-UTR与miR-146a-5p具有结合位点。荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-146a-5p对GPR17表达具有负调控作用。降低miR-146a-5p可逆转珍宝丸对缺氧诱导的GPR17上调的作用,逆转珍宝丸对缺氧诱导的细胞凋亡的抑制作用及增强珍宝丸对ASCI大鼠后肢运动功能的恢复。因此,珍宝丸能增强后肢运动功能,减轻急性脊髓损伤引起的炎症反应。结论珍宝丸可通过调节miR-146a-5p/GPR17表达来抑制神经细胞凋亡,进而促进脊髓功能恢复。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R285.5

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