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《武汉大学》 2003年
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性别发育基因P450c17、DMY和Dmrt1的克隆、表达及选择性剪接研究

余红仕  
【摘要】:性别发育是基本的生命活动过程,它是一个涉及多个基因时空表达的网络调控体系。性别决定与分化也是研究器官形成与分化的良好模式。尽管至今已提出一些理论来解释性别决定与分化过程,包括基因型性别决定、环境性别决定以及社会群体性别决定等,然而对其分子机制和进化规律还缺乏深入的认识。 黄鳝是我国淡水鱼中的一种具有天然性反转生理特性的鱼类,即由雌性、间性到雄性发育的过程;青鳉是一种小型卵生的淡水鱼,其有类似于人类的XY染色体。因而它们成为研究性别发育的良好模式生物,对其性别发育机制的阐明有助于人类认识自身,为性别相关疾病防治提供理论依据。本文在研究黄鳝性别分化基因和青鳉性别决定基因时,首次发现了黄鳝性别分化基因P450c17(CYP17)存在选择性剪接现象,同时也发现了青鳉性别主基因DMY以及Dmrt1存在类似的选择性剪接现象。 1.黄鳝P450c17基因的选择性剪接——克隆、结构与表达分析 利用SMART技术合成了不同性别黄鳝性腺cDNA,并采用RACE方法扩增得到了黄鳝四个CYP17全长cDNA(Genbank登录号为:AY224681-AY224684)分别为CYP17-a1(3312bp)、CYP17-a2(1934bp)、CYP17-b(1676bp)、CYP17-c(1121bp)。序列分析表明,它们3′端的序列各不相同,是通过选择性剪接或选择性加尾产生,编码了三种不同的 蛋白质(517个氨基酸,512个氨基酸和159个氨基酸)。进一步分析表 明,P45O结构域是高度保守的,尤其是靠近5’端。 根据上述全长基因设计编码区的特异引物进行组织表达谱分析, Rl’- PCR结果表明CYPI7基因的各种转录本在卵巢、间性性腺和翠丸中 都有表达,在脑中仅有CYPI 7-c有少量的表达外,其它组织如心、肝、 肾中都没有任何转录本的表达,说明该基因主要性腺中表达,与性别发 育有极为密切的关系。 Northem杂交验证了各种转录本在三种性腺中的表达模式。从黄鳝 翠丸、卵巢和间性性腺提取总RNA(各1 0 pg),然后在1 .0%的琼脂糖凝 胶电泳分离并转膜,以黄鳝CYPI 7-a2的3,.RACE产物(l .6kb,包含保 守的P45o结构域)标记探针([a一32P]deTP),在u耳队hyb(Ambion) 公司的杂交液中42℃进行Northern杂交16小时以上,结果表明CYPI7 基因主要是CYPI 7-al的表达(约3.3kb),而且翠丸大于卵巢,二者都远 远大于间性性腺。其次是相对较弱的CYP了7-b的表达(约1.7kb),而在 CYP了7-aj和CYP了7-b之间有更弱的CYPI 7-a2表达,而CYP了7-c的表达 在该条件下没有信号。 为进一步深入研究CYP17基因在性别分化中的作用,我们采用了性 腺切片进行组织原位杂交(In siru hybridization)。digoxigenin一UTP标记 正义RNA探针和反义RNA探针包含黄鳝 CYP了7-a2(l .6kb)的P450结 构域,即分别用SP6或T7 RNA聚合酶转录(SP6启动子转录得到的探 针为正义探针,T7启动子转录得到反义探针)。据Boehringer操作指南 首先进行性腺组织冰冻切片,立即42℃进行杂交,杂交信号用NBT/BCIP 系统进行显色。结果表明CYP了7基因在生殖婿的上皮细胞特异表达,而 在发育的生殖细胞中没有表达。另外杂交信号强度翠丸大于卵巢,两者 都远远大于间性性腺,此结果与 Northem杂交结果相印证。 在邻接法(NJ法)进行脊椎动物CYP17蛋白的聚类分析时,采用 dustalx(1 .81)软件进行序列的联配,并用bootstrap进行赋值,得到脊 椎动物CYP17蛋白的系统发生树。结果表明哺乳动物属同一分支,而黄 鳝CYP17蛋白特异地与鱼类属另一分支。 Southem杂交是进行基因组DNA特定序列定位。本实验从雌雄黄鳝 血液中提取基因组DNA,10 pg基因组DNA用EcoRI酶消化,0.8%的 琼脂糖凝胶电泳(Iv/cm)分离并转膜,以黄鳝CYPI 7-a2(l .6kb,包含 保守的P45o结构域)标记探针([a一32P]deTP),在u叮队hyb(Ambion) 公司的杂交液中42℃进行SOuthem杂交,结果在约6.skb处得到与黄鳝 CYP17基因同源的杂交信号。 空间结构为功能预测奠定基础,为此我们对黄鳝CYP17蛋白进行了 空间结构分析。首先利用DNAstar软件对黄鳝CYP17蛋白进行二级结构 预测表明该蛋白主要由Q螺旋和p折叠组成,尤其是4一25和35一57的 两个跨膜Q螺旋,可能与其进行膜内外电子传递功能有关。根据现有的 CYP17蛋白晶体结构,唯有P45OBM3与真核生物有相近的空间结构, 采用比较建模法进行黄鳝CYP17一al蛋白的空间结构预测。构建了黄鳝 CYP17空间结构模型,表明其功能活性区(血红素结合位点和底物结合 域)高度保守,为该基因深入地功能分析奠定基础。 以上这些结果说明,黄鳝CYP了夕基因表达存在时空差异,与黄鳝天 然性反转过程相一致,暗示它在性别分化中的潜在重要作用。 2.青锵刀材Y和Dmrtl基因的选择性剪接分析 利用SMART技术分别合成了青鳄雌性和雄性性腺cDNA,在D材r 和刀脚rtl基因的保守区设计引物,进行3.RACE分析。在mRNA水平上 发现了青鳄D初了和Dmrtl基因3’端存在类似于黄鳝CYPI7基因的选择 性剪接现象。 首次发现了青鳄D材y基因两个选择性剪接(D拟下“与D例子b),而 D材Ka存在多态性,产生两种转录本(。材Kal和刀泪子a2)。DMY三个转 录本的产度分别是1342bp、1334bp和92lbp,相应编?
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q78

【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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