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《武汉大学》 2003年
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CSFV石门株基因组感染性克隆的构建与致细胞病变分子机制研究

吴海祥  
【摘要】:猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)强毒株感染猪体引起90%以上的感染猪死亡。猪瘟的流行给世界范围内畜牧业的发展和贸易造成了巨大损失。猪瘟病毒感染造成机体多种组织损伤,但在离体培养细胞中通常不产生致细胞病变效应(cytopathic effect, CPE),对猪瘟病毒致病机制的研究,因为缺少合适的细胞研究模型而进展缓慢。 最近国外报道,从自然界中分离出三株能够在培养细胞中产生病变的猪瘟病毒干扰缺损颗粒,研究发现干扰缺损颗粒亚基因组的存在是细胞产生CPE的原因。野生型CSFV非结构蛋白NS2和NS3以二联体形式NS2-3存在,而在干扰缺损颗粒中,NS2基因连同上游的全部编码区被缺失,NS2-3二联体变成NS3单体。分析发现,致细胞病变型猪瘟病毒NS3蛋白单体的过量表达是细胞产生CPE的标志。 我们对引起温和型猪瘟的持续感染毒株CSFV39进行了全基因组序列测定,并将CSFV39与Shimen强毒株和兔化弱毒疫苗株HCLV进行了序列比较。全基因组和蛋白组序列比较结果证实CSFV39与中国标准强毒Shimen株具有更高的同源性。推测猪瘟病毒持续感染毒株的产生,可能是长期流行的强毒株在免疫压力下毒力弱化的结果。在这种形势下,深入研究猪瘟病毒强毒株致病机制,是对病原体基础研究的一个挑战。我们选择猪瘟病毒中国标准强毒Shimen株为研究材料,在本实验室已测基因组全序列基础上,构建了Shimen株基因组感染性cDNA克隆,并建立了猪瘟病毒体外培养的致细胞病变模型,比较系统地研究了猪瘟病毒致细胞病变的分子机制。 通过RT-PCR扩增和逐步连接的方法获得了猪瘟病毒Shimen株全基因组cDNA克隆pT7SM。在T7 RNA聚合酶作用下,pT7SM转染PK-15细胞,产生出有感染性的病毒粒子。以有感染性的全基因组cDNA克隆为操作平台,相继构建了两个猪瘟病毒亚基因组cDNA克隆,在验证从自然界中发现的亚基因组干扰缺损颗粒诱导宿主细胞产生病变的同时,构建了一株缺失非结构蛋白NS2基因的缺陷型病毒vSMD8。利用vSMD8在PK-15细胞上建立了体外研究猪瘟病毒致病机制的致细胞病变模型。对模型的研究发现,缺陷型病毒引起PK-15细胞产生CPE的主要原因是被感染的宿主细胞产生了凋亡。缺陷型病毒vSMD8中,通过人工方法提高了NS3蛋白单体的表达量,过量表达的NS3蛋白诱导CPE主要表现为细胞凋亡,表明NS3蛋白是一种诱导细胞凋亡的功能蛋白。 利用建立的致细胞病变模型,我们研究了猪瘟病毒非结构蛋白NSZ 在缺陷型病毒诱导CPE中的作用。在表达NSZ蛋白的PK一巧细胞中,缺 陷型病毒诱导的致细胞病变效应被抑制了,表明宿主细胞中NsZ蛋白的 表达对缺陷型病毒的亚基因组NsZ基因的缺失起到了互补作用,NsZ蛋 白功能上的互补抑制了缺陷型病毒诱导宿主细胞病变的发生,并且使其表 型变为与非致细胞病变的野生型猪瘟病毒相同。由于NS3蛋白在干扰缺 损颗粒致细胞病变过程中,具有关键的诱导作用,所以我们可以推测,非 结构蛋白NSZ无论以单体形式,还是以野生型病毒中的NSZ一3二联体形 式存在,都能够抑制NS3蛋白单体对宿主细胞CPE的诱导作用。最后通 过生物信息学方法分析,进一步证实了CSFV NSZ蛋白是抑制细胞凋亡的 功能蛋白,并对其发挥抑制功能的机制进行了探讨。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
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【共引文献】
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