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《武汉大学》 2004年
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植物钙调素结合蛋白激酶的基因分离、鉴定及生物学功能分析

马力  
【摘要】:Ca~(2+)作为第二信使在生物体中起广泛的作用。Ca~(2+)是细胞刺激—反应信号转导机制中的关键信号分子,在生物体响应外界胁迫中发挥重要作用。响应各种外界刺激(如光、重力、生物的和非生物的胁迫、激素),Ca~(2+)梯度分布在静止状态下是相对稳定的,在受到刺激时会发生变化,Ca~(2+)梯度是Ca~(2+)信号产生的基础,这样就产生钙信号。植物细胞内钙离子浓度的微小变化都可能直接或间接地影响细胞的生理生化活动。作为简单的金属离子钙能调控众多的细胞活动,主要是通过胞质游离钙的瞬间变化调控其靶蛋白如钙调素、CDPK等,而诱发一系列下游应答事件。 钙调素(calmodulin, CaM)是已经被广泛深入研究的钙靶蛋白之一,此蛋白在真核细胞中广泛表达,在Ca~(2+)信号转导系统中发挥着重要作用。因而对其研究迅速深入到生物化学,细胞生物学和分子生物学的各个重要领域。 钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase, CDPK)最初是由Harmon等人从大豆中分离出来,部分纯化的激酶能被微摩尔浓度的Ca~(2+)激活,但不依赖CaM和磷脂。随后在苜蓿、苹果和绿藻中也发现了这种蛋白激酶。研究表明CDPK广泛存在于各种植物体内,是植物体最大的Ca~(2+)调(Ca~(2+)-sensitive)蛋白激酶家族,仅在拟南芥基因组中就有超过40个的家族成员。 CDPK具有三个功能区:N端的Ser/Thr激酶催化区,能使底物特定部位的Ser/Thr磷酸化;C端是类似于CaM的调节区,此区与CaM有约40%的同源性,有四个EF手型结构,能与四个Ca~(2+)进行结合;中间为自主抑制区由大约30个左右氨基酸残基组成。当Ca~(2+)与CDPK的CaM相似区结合后,其分子内发生了的构象变化,CaM 相似区折叠过来与上游的自主抑制区相结合,从而压抑自主抑制,激活CDPK。研 究表明对于去掉了CaM相似区的缺失CDPK,和一个独立的CaM相似区在同一反 应体系中存在时,在3林M浓度时,能达到完整CDPK酶活的一半。植物CDPK在与 c扩+结合被激活后,能对下游的多种靶蛋白进行磷酸化修饰,从而启动植物体内的一 系列的生理生化反应,包括植物生长发育、性别调控、物质和能量代谢、光信号转 导、植物的耐盐抗旱和超敏反应等各方面。ccaMK能结合c扩十和c扩+ICaM,其酶. 活受c扩+和caM共同调节。oscBK是水稻中一种新型的钙调素结合的蛋白,即具 有结合钙调素的特性,同时是一种蛋白激酶但其酶活不受CaM调节。 钙调素已被广泛证明在植物生长发育过程中起重要调控作用,而钙调素结合蛋 白激酶(ealmodulin一binding protein kinase,eBK)是钙/钙调素介导的钙调素信号转导系 统中的重要组成因子。利用原核和真核的表达系统表达植物钙调素结合蛋白激酶, 拟南芥钙调素调节的CDPK相关蛋白(AtCRKS)和烟草钙调素依赖型蛋白激酶 困tCaMKI)的深入研究必将对此领域作出有意义的贡献。 本课题主要由相关的两部分工作组成,一是利用基于双元载体构建的完全覆盖 拟南芥基因组DNA的文库,通过农杆菌真空侵染方法转化拟南芥,构建拟南芥突变 体库。建库所用载体pMD一1(来源于双元载体pBI 1 21)提供了适合拟南芥中表达的 CaMV 355强启动子和NOS-te;终止子,使所插入的基因组DNA中如果含有某个基 因的全部甚至部分序列,当其与启动子同向,则极有可能超表达,当其与启动子反 向,则有可能产生反义抑制,此外外源片段整合入基因组,也可能导致某个基因失 活,因此获得的转基因植株库中可能包括超表达突变体和反义抑制突变体(一般为 显性突变体)以及插入突变体(一般为隐性突变)。通过优化拟南芥的栽培、转化以 及转基因植株的筛选和鉴定方法,建立了一个稳定的技术平台。开花时间的调控是 植物生殖成功的关键。我们设计的随机基因组文库的方法通过过量表达或者阻遏基 因表达来打破基因家族的基因表达水平的平衡进而可以获得基因家族的表型。我们 筛选到的调节拟南芥开花时间的新基因是受钙调素调节的CDPK相关蛋白 (AtCRKS)。AICRKS影响拟南芥从营养生长向生殖生长的转变。AicRKS基因包含了 11个保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化亚区。我们进行了CaM结合实验和在基因 数据库里查AtCRKS和其它钙调素结合蛋白激酶的同源性。在动物中钙调素结合蛋 白激酶的钙信号途径已经建立,然而植物的钙调素蛋白激酶的功能几乎不为人所知。 在本研究中我们揭示了AtCRKS影响拟南芥从营养生长向生殖生长的转变,延迟拟 南芥的开花时间。拟南芥的开花调控是个复杂的信一号调控网络,在拟南芥中有几条 途径包括光周期(photoperiodie)途径,春化(vemalization)途径,自主(autonomous) 途径和GA途径来控制开花时间。FLC是春化途径和自主途径的关键基因。为了研 究AtCRKS在晚开花LFI中扮演的角色,我们设计了长日照/短日照,春化和GA处 理LFI的实验。对其调控开花途径的进一步研究分析表明,结果表明此基因参与了 赤霉素介导的植物开花调控作用。这是首次有资料证明了钙调素调节的CRK信号系 统调控拟南芥的开花时间。 另一部分工作是分离和鉴定烟草的钙调素依赖型蛋白激酶。通过蛋白和蛋白的 ?
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:Q946

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【引证文献】
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1 王秋实;乌塌菜和白菜臺核复等位基因雄性不育系的创制与利用[D];沈阳农业大学;2013年
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1 龚乐;一种新型钙调素结合蛋白—金属蛋白酶在龙须菜高温胁迫中的表达模式研究[D];中国海洋大学;2014年
2 刘莹;GsCBRLK和GsST2基因改良农菁1号苜蓿耐盐性的研究[D];东北农业大学;2012年
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【参考文献】
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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10 杨凤秋;陈东玫;张朝红;赵同生;张新生;李春敏;赵永波;翟莹;;苹果杂种果实钙含量的遗传分析[J];河北农业科学;2015年01期
【同被引文献】
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1 黄镇;分子标记辅助选择培育新型甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育系[D];华中农业大学;2009年
2 马力;植物钙调素结合蛋白激酶的基因分离、鉴定及生物学功能分析[D];武汉大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张璇;龙须菜高温胁迫响应的钙调素信号传导途径的研究[D];中国海洋大学;2012年
2 高德伟;不同黑木相思无性系若干生长和生理过程研究[D];福建农林大学;2011年
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4 邵红雨;小黑麦耐盐生理生化特性及其利用价值的研究[D];石河子大学;2007年
5 孙健;水稻蛋白激酶高通量克隆表达及初步活性分析[D];河北农业大学;2006年
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8 肖雪;四个玉米逆境响应蛋白激酶在转基因拟南芥中的亚细胞定位[D];南京农业大学;2006年
9 盛慧;DREB2A、SCMRP基因双价植物表达载体的构建及对苜蓿的遗传转化[D];东北农业大学;2006年
10 陈吉宝;小麦TaDREB1基因的单核苷酸多态性及其与抗旱性的关系[D];西北农林科技大学;2005年
【二级引证文献】
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1 牛梦莹;苜蓿耐盐根瘤菌菌株筛选[D];西北农林科技大学;2018年
2 李青萍;柑橘砧木耐碱性及对碱性环境适应性评价[D];西南大学;2017年
3 金敏;水盐胁迫下双峰驼肾脏与肠道组织中钙调素的表达[D];内蒙古农业大学;2015年
4 马嘉敏;苜蓿根际促生菌的分离及促生作用研究[D];哈尔滨师范大学;2013年
5 刘峄;葡萄ACS和ETR基因的功能初探[D];河南农业大学;2013年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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4 陈绍荣,吕应堂,杨弘远;钙调素mRNA在烟草花药发育过程中的原位定位[J];科学通报;1998年20期
5 马力耕,徐小冬,崔素娟,孙大业;细胞外钙调素对花粉萌发和花粉管伸长的影响[J];科学通报;1997年24期
6 马力耕,崔素娟,徐小冬,孙大业;G蛋白在细胞外钙调素启动花粉萌发和花粉管伸长中的作用[J];自然科学进展;1997年06期
7 王朝晖,孙大业;植物钙调素研究进展[J];植物学通报;1997年01期
8 张劲松,杨弘远,朱绫,童华;向日葵柱头、花柱和珠孔中钙分布的超微细胞化学定位[J];植物学报;1995年09期
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【相似文献】
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2 胡卓逸,陈少林,郝志奇,黄文龙,彭司勋;苄基异喹啉类生物碱及其类似物抑制钙调素刺激的磷酸二酯酶的活力[J];徐州医学院学报;1988年01期
3 张志明,文允镒;钙调素与中枢神经系统的某些功能[J];生理科学;1988年S1期
4 叶正华,孙大业,郭季芳;小麦细胞壁钙调素的研究初报[J];科学通报;1988年08期
5 卢坤平,赵昇皓,王道生;钙调素可能是调节血管平滑肌细胞增殖的因素[J];科学通报;1988年10期
6 张明志,于宏林,张光毅,赵升皓;钙调素抗体的制备和鉴定[J];徐州医学院学报;1989年03期
7 ■佳程,吴兆锋,刘秉文;猪脑钙调素的分离、纯化及鉴定[J];华西医科大学学报;1989年03期
8 卢坤平,赵升皓,王道生;重金属离子刺激主动脉平滑肌细胞的增殖[J];中国科学(B辑 化学 生命科学 地学);1989年07期
9 魏群,Devid Cheng,Ernest Y. C. Lee,Keith Brew;选择标记法对钙调神经磷酸酶和钙调素结合位点的研究[J];生物化学与生物物理进展;1989年04期
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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6 秦云龙;刘菁;李欣;魏群;;重组单链钙调素/钙调磷酸酶复合物的性质与功能[A];第七届全国酶学学术讨论会论文摘要集[C];2004年
7 刘德龙;王惠娟;白娟;孙大业;;荧光法研究Ce~(3+)与钙调素的结合反应[A];第八届全国发光分析暨动力学分析学术研讨会论文集[C];2005年
8 刘宏涛;孙大业;周人纲;;钙-钙调素对拟南芥热激基因表达的影响[A];中国细胞生物学学会第八届会员代表大会暨学术大会论文摘要集[C];2003年
9 陈以峰;梁世平;杨弘远;;烟草胚囊胞外钙调素的免疫电镜定位[A];第十次全国电子显微学会议论文集(Ⅰ)[C];1998年
10 胡文全;马敏;谢万钦;张映熠;张蕊;金犁天;李翠凤;;钙调素参与植物转脂蛋白功能调节的证据[A];中国植物生理学会第十次会员代表大会暨全国学术年会论文摘要汇编[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 樊江涛;孙大业:科学家必须是个老实人[N];河北日报;2006年
2 本报记者 耿建扩 通讯员 赵振军 周红松;细胞探秘人[N];光明日报;2005年
3 本报记者 樊江涛;孙大业探密细胞50载[N];河北日报;2009年
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1 华玮;烟草钙调素结合蛋白激酶的酶学特性及功能分析[D];武汉大学;2003年
2 马力;植物钙调素结合蛋白激酶的基因分离、鉴定及生物学功能分析[D];武汉大学;2004年
3 尚忠林;细胞外钙调素对花粉细胞内钙离子的影响及其信号传递途径的研究[D];中国农业大学;2001年
4 董爱武;植物中可异戊烯化修饰的重要功能蛋白的研究[D];复旦大学;2003年
5 吕莹果;米糠谷氨酸脱羧酶的分离纯化及其性质研究[D];江南大学;2009年
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8 赵艳;甲醇和乙醇促进油菜生长和光合作用的分子机理研究[D];昆明理工大学;2014年
9 李兴军;杨梅花芽孕育及发端调控的研究[D];浙江大学;2001年
10 修宗昌;脾虚证Ca~(2+)/CaM信号系统的实验研究[D];辽宁中医学院;2001年
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1 舒茂荣;百脉根钙调素基因的鉴定及LjCaM4的表达分析与活性检测[D];四川农业大学;2017年
2 冯若芸;烟曲霉中钙调素蛋白依赖其钙离子结合位点的分子特征及其重要生理功能研究[D];南京师范大学;2018年
3 张磊;土生隐球酵母菌中钙调素与钙调磷酸酶的结合位点研究[D];昆明理工大学;2015年
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8 于雪丹;毛白杨PtCaM的克隆及功能分析[D];中国林业科学研究院;2009年
9 金敏;水盐胁迫下双峰驼肾脏与肠道组织中钙调素的表达[D];内蒙古农业大学;2015年
10 杨静;诱导表达细胞CaM对烟草抗逆性的调控效应及其生理生化机制[D];云南师范大学;2003年
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