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《武汉大学》 2004年
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烟草合子培养再生植株与体外胚胎发生系统的创建

何玉池  
【摘要】:本试验以烟草品种SR-1、W38、革新一号为材料。采用酶解—研磨法分离受精后的生活胚囊,再通过控制取材的时间以及二次酶解时间的长短,获得不同发育时期、不同细胞壁状态的烟草合子。通过培养条件的优化,使烟草合子在体外通过器官发生途径与胚胎发生途径两种方式再生可育植株,从而创建了烟草合子的体外胚胎发生系统。同时研究了细胞壁与合子的定向生长对离体合子胚胎发生的影响。建立了烟草合子的单细胞压片技术,对自然合子以及离体发育合子的细胞器DNA的分布进行检测和监控。此外,还利用合子时期的烟草胚珠,建立了一种简单的合子原位离体胚胎发生系统。主要试验结果如下: 1.在前人所创烟草合子分离方法(酶解-研磨法)的基础上,对烟草合子在分裂前具有较长时间休眠期的特点进行了具体分析,改进原有的单一的二次酶解时间,设计了一系列的二次酶解的时间梯度实验,不仅可以获得原生质体状态的合子,而且可以获得细胞壁完整的长形合子以及残存不同程度初生细胞壁的合子,使研究的对象更为丰富。依据108 HAP(授粉后小时)的合子分离后的纵横轴比例,将合子人为划分为五类:合子原生质体;Z1类(纵横比1.0:1.0,依然可见残存的细胞壁);Z2类(纵横比1.2:1.0);Z3类(纵横比1.5:1.0);Z4类(纵横比大于2.0)。并进一步对不同类型合子的离体发育前途进行了比较研究。 2.以受精后的烟草胚珠作为饲养系统,通过微室培养技术成功地诱导了烟草合子的离体发育,并经器官发生途径再生可育植株。研究表明,选择烟草品 种SR一1为材料,采用MS大量成分附加KM8p微量元素及其他成分为基本培养基, 以120 HAP的胚珠作为饲养系统,可以诱导108}认P的合子80%以上发生一次 分裂,接近10%的合子形成愈伤组织并进一步分化形成可育植株。 3.通过极短时间二次酶解或者机械解剖的方法,获得细胞壁较为完整的Z4 烟草合子。通过对多种不同激素组合的培养基比较,发现M3形成胚以及分化为 成熟胚的能力强于M5,但是从胚胎系统创建的角度分析,M5优于M3。不同的培 养方法比较试验表明,培养方法D是诱导体外胚胎发生的优化条件,即在微室中 和饲养细胞中添加不同的培养基,在发育的整个过程中没有出现明显偏离胚胎发 生的现象,对于解决胚胎早期偏离发育模式的问题有较好的改进作用,最终使合 子保持较好的胚胎形态直至分化;培养方法C虽然没有获得分化的胚胎,但胚胎 早期的分裂模式可以最大程度的模拟体内自然模式。对早期的胚胎发育模式,包 括一次分裂的形式,顶细胞分裂的形式,基细胞分裂的形式以及胚柄的数日进行 调查分析,对合子体外胚胎发生的技术路线进行了总结。本实验创建的系统,证 明了合子可以在体外实现全程的胚胎发生,尤其是在发育的初期可以较好模拟体 内胚胎发育模式。 4.通过控制取材的时间,以人工授粉后一定的时间间隔为取材的依据,人为 地将合子划分为五个发育时期,对合子定向生长过程中各种形态指标的变化进行 广泛调查,不同发育时期的合子在其面积、周长、纵轴长度、纵轴长度/横轴长 度的比值等方面均表现为增加的趋势,但是增加的速度不是匀速的,前期增加相 对缓慢,在休眠后期,各种指标迅速增加。然而横轴长度在定向生长过程中有一 个微弱的降低。 5.充分利用烟草合子具有较长休眠期的特点,通过控制分离过程中二次酶解 的时间,获得相同发育时期具有不同细胞壁状态的合子。对21一Z4四类合子在体 外培养过程中的发育命运进行跟踪,并且详细分析了四类合子早期的分裂模式。 研究结果表明,细胞壁的不同状态明显影响合子的分裂模式以及发育命运,只有 细胞壁较为完整、纵横比大于2.0的Z4合子,才可以严格遵循体内的发育模式, 在合适的条件下,形成与体内基本相同的胚胎。本试验不仅研究了同一发育时期 不同细胞壁状态的合子体外发育的情况,也分析了同一发育时期原生质体状态的 合子与具有完整细胞壁合子在体外诱导时所表现出的分裂模式及发育潜力的差 别。通过以上试验,讨论了细胞壁的存在与否以及细胞壁的不同状态对合子离体 胚胎发生的影响。 6.利用单细胞压片技术分析了不同发育时期的烟草合子以及短时培养后的 合子中的细胞器DNA分布状况,结果显示体内发育的合子和离体发育的合子原生 质体内线粒体、质体的分布模式明显不同,体内正常发育的合子其线粒体、质体 的分布随着合子的定向生长由均匀分布逐渐变为极性分布。而离体发育的合子原 生质体内则基本保持了均匀分布的状态。定向生长过程中,细胞核也移动到合点 端,最终定位于即将发生分裂的位置。 7.结合合子体外培养技术,对一于合子原生质体在体外能否重现体内的定向生 长过程进行了详细深入的调查,以不同发育时期的合子原生质体为材料,设计了 一系列不同的培养条件,力求回答合子原生质体在体外能否定向生长的问题,最 终弄清定向生长对于胚胎发生的影响。试验结果显示,原生质体状态的合子在体 外培养过程中不能定向生长,不能模拟和再现体内自然合子定向生长的过程,也 不能模拟体内胚胎发生。 8.合子时期烟草胚珠的体外诱导表明,合子时期胚珠
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S572

【参考文献】
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