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血管紧张素Ⅱ受体反义核酸转染心肌细胞的研究

王颖  
【摘要】:背景:越来越多的证据表明,肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Rennin angiotensin aldosterone system,RAS)过度活跃在多种心血管疾病的发生、发展中发挥重要作用。目前在临床上广为应用的血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅲ受体1(angiotensin Ⅱ receptor 1,AT_1)拮抗剂能有效地抑制RAS,降低和控制血压,并且对靶器官有良好的保护作用。但它们也有一些不足之处,如药物的有效作用时间相对较短(≤24h),特异性相对较差,长期服用有一定的副作用,常因病人长期服药的依从性差而影响降压效应,尤其是那些无症状患者。据报道,到目前为止也只有20%~35%的病人血压得到了真正的控制。随着近年来分子生物学理论与技术的发展,特别是在靶基因界定和载体构建方面取得的重大进展,高血压的基因治疗成为新的探索。反义寡核苷酸(antisense oligonuleotides,AS-ODNs)技术是目前基因治疗的常用方法之一,它操作简便、快捷、经济,风险/收益比低,因此在心血管疾病的基因治疗中比其他方法更具实用性。此前多项以AT_1为靶基因的AS-ODNs,在多种高血压动物模型中显示了良好的降压效果。但这些研究多侧重于AT_1基因被封闭后实验动物血流动力学的改善情况,高血压组织重构的相关研究较少。由于并非所有的细胞都可被寡核苷酸成功、高效转染,加之迄今为止尚未见AS-ODNs转染心肌细胞及其动力学的相关报道,因此尚不能肯定在活体研究中,AS-ODNs的一些心肌保护效应是由于其直接作用于心肌细胞的结果,而并非是作用于心肌成纤维细胞、内皮细胞,或是由于血流动力学的改善而产生的间接性结果。 目的:针对这种情况,本研究以体外培养的乳鼠心肌细胞为实验模型,通过观察转染过程中AT_1-AS-ODNs在心肌细胞内的时相分布特点,转染效率及细胞毒效应,探讨AT_1-AS-ODNs转染心肌细胞的可能性;同时检测AT_1-AS-ODNs转染后,对AT_1基因表达的抑制效应;并探讨在缺乏或存在外源性过度生长刺激的条件下,封闭AT_1表达对心肌细胞生理、病理生长的影响。 方法:本研究应用胰蛋白酶和胶原酶联合分段消化法分离心肌细胞,采取差速贴壁的方法对心肌细胞进行纯化,原代培养,建立细胞模型。免疫细胞化学技术进行α 一Sarcomeric actin染色,鉴定心肌细胞纯度。以脂质体为传递体系,携带AT,一AS一ODNS 转染心肌细胞。显微荧光技术监测ATI一AS一ODNS在心肌细胞内的时相分布及转染效 率。MTT法结合倒置相差显微镜分析转染复合物对心肌细胞的细胞毒作用;蛋白印迹 技术检测ATI一AS一ODNs进入心肌细胞后对靶基因的抑制效应。流式细胞仪检测心肌细 胞周期分布、细胞内DNA合成及凋亡百分率;免疫沉淀技术检测细胞内p46JNK、 P54则K活性;免疫细胞化学检测核转录因子c一Jun蛋白表达水平;放免法检测细胞内 心钠素(忽rial natriuretic faetor,ANP)合成、分泌情况。 结果: 第一部分免疫细胞化学染色示90%以上的培养细胞Q一Sarcomeric actin抗原染 色呈阳性,表明细胞模型构建成功,心肌细胞纯度达90%以上。显微荧光技术证实, 当单独转染心肌细胞时,AT,一AS一ODNs(裸DNA)于转染30min后开始进入细胞,转 染阳性细胞数不及23%;6Omin后转染效率达峰值为30%,此时转染阳性细胞核内有 点状荧光物质积聚;120min后,细胞内的荧光强度降低;至24Omin后,基本消失。 在脂质体的介导下,ATI·AS一ODNs于3Omin开始进入细胞,在胞浆内呈点状分布;60一 120min迅速积聚于细胞核,转染效率达60%,此后平缓降低;24Omin时荧光AS一ODNs 仍稳定存在于细胞核与细胞浆内,转染效率仍维持于50%左右。MTT实验证实,无论 是AT】一AS一ODNS单独转染,还是脂质体包裹ATI一AS一ODNS共同作用于心肌细胞,各 时间点OD值与对照组相比均无显著差异。倒置显微镜下,也未见心肌细胞发生明显 的贴壁、伸展状态改变或细胞脱落、悬浮增加的现象。 第二部分为避免非特异性抑制效应,本研究应用的AS一ODNs的浓度相对较低, 仅为ZO0nlnol/L,但其抑制效应显著。AT,一AS一ODNs转染24h后,心肌细胞内AT,蛋 白表达显著降低,为对照组的393%,而AT,一S一ODNs无效。Angn(10一6 mol/L)刺激 24h,负性调节AT,基因表达,替米沙坦(10一5 mol/L)干预对此有明显抑制作用。与 替米沙坦不同,AT,一AS一ODNs预处理并没有逆转Angll诱导的AT;蛋白表达下调,相 反Angll刺激经ATI一AS一ODNs预处理后的心肌细胞,ATI表达水平进一步降低。 第三部分ATI一AS一ODNs转染24h后,心肌细胞贴壁伸展状态良好,未见明显细 胞脱落、悬浮现象;转染24h内各时间点细胞MTT产物的OD值及细胞搏动频率与对 照组相比均无显著性差异。对照组心肌细胞内p46则K、p54JNK的基础活性较低,但 存在一定量的c一Jun蛋白表达,细胞凋亡百分率为1.09%。AT、一AS一ODNS转染对细胞 内则K活性、。一Jun蛋白表达量及凋亡均无显著影响。增殖周期及DNA含量分析证实, AT,一AS一ODNS转染后心肌细胞周期分布及各期DNA含量与对照组相比均无显著差 巳 岁十。 第四部分灿911(10一6mol几)刺激心肌细胞3omin后,p46JNK、ps4州K被显著 激活,分别为对照组的2.5和3.1倍;刺激


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