水稻红莲型细胞质雄性不育与育性恢复的分子机理

【摘要】：保持粮食产量的稳步提高以满足日益增长的人口需要是国民经济持续健康发展的保证。水稻是我国最主要的粮食作物，在水稻生产中，杂交水稻比常规稻增产约20％，扩大水稻杂交优势的利用对于我国将来的粮食供给保障举足轻重。当前水稻杂交优势利用的基础是细胞质雄性不育系统，探讨水稻细胞质雄性不育和育性恢复的分子机理对于我们进一步开展杂交优势利用具有重要意义。为此，我们以红莲型水稻为材料，对水稻细胞质雄性不育和育性恢复的遗传及其分子机理进行了探讨，获得如下研究结果： 1．为了探讨红莲型水稻细胞质雄性不育的发育机理，我们以粤泰A、B为材料，分析了小孢子败育与细胞凋亡的关系。TUNEL检测发现当小孢子母细胞发育到减数分裂期，粤泰A中的小孢子母细胞发出强烈的绿色荧光信号，而粤泰B则为红色，表明粤泰A小孢子母细胞核DNA发生了断裂。而且粤泰A自四分体时期开始出现DNA的片段化，单核早期则可见有明显的DNA ladder；而粤泰B中则没有观察到类似现象。表明红莲型水稻小孢子的发育过程是一个典型的细胞程序性死亡过程。 在小孢子发育过程中，线粒体膜透势在四分体时期的变化最明显，彼此间达到了极显著水平差异；表明小孢子线粒体内膜透势的变化与小孢子核DNA断裂具有良好的对应关系。在此过程中，粤泰B线粒体中ROS含量保持相对稳定，一直维持在较低水平；而粤泰A的ROS含量从减数分裂期开始逐渐上升，至单核早期最高达到粤泰B的4.5倍；表明在红莲型水稻不育系小孢子的发育早期，氧自由基的增生异常活跃。抗氧化系统酶活性分析表明，在小孢子发育进程中，线粒体内SOD、APX、CAT的活性都受到了氧自由基的调控，表现出下调的趋势，其变化主要出现在减数分裂期以后。这些结果表明红莲型水稻小孢子发 育过程中的细胞程序性死亡与线粒体中的氧化胁迫密切相关。 2.为了探讨红莲型细胞质在野生稻中的分布一与起源，以红莲型细 胞质雄性不育札!关华囚ol刀厂夕作为分子标记，以粤泰A、B作对照， 根据01:/717夕序列设训‘引物，采用PCR扩增对42份AA基因组野生稻 进行了筛选。发现wll、wls、wZo、wZI、w29和w34、w42和w46等 8份野生稻的妇“增带型与粤态A完全一致，而其它野生稻和粤态B一 样为空柱一}。Sotlthcl’n blot分析表明这些野生稻线粒体其因组中含有 o刁了-I7夕同沥}片段，说明这8份野生稻拥有oI刀了7夕基因。这8份野生稻 分布在4个野生稻种中。序列分析表明，除w42和w46与粤态A完全 相同外，在其它6份野生稻中发现了13个核二价酸变异位点，其中9个 变异导致氨纂酸组成发生改变。从中随机选择5份含红莲型细胞质的 野生稻作母木与保持系粤泰B进行杂交，其F:代的育性或不一育或部分 可育。进一步回交，可育F:衍生的BC:FI发生育性分离，分离比符合 l:l。不育株败育花粉粒绝大部分呈圆形，圆败比例随回交1过代的增加 而上刀·;在12一Kl溶液中着浅色或不着色，说明这些野生稻含有典型的 全_{_莲型细胞质。线粒体从囚红_}玄产i构分析表明，野二匕稻与粤态B杂交和 回交过程中，线粒体基因织.‘一!，的部分墓因发斗几了重组，重111.过程主要 发生在回交第·代(BC;);也即野生稻当代、F、的带型基木一致，而 BCIF卜BCZI:l的带型荃木一致。在所分析的8个探针中，只有。lP夕、 eox3不lj，，c，办的·{}护型没有变化，「rlJ‘，州、alj7‘、cob、coxj不!1 nadj的带 型发生了改变。 3.选择9311、密阳23和培C3ll三个红莲型恢复系，对它们所含 的红莲J怜恢复华1引位点关系进行了比较分析。遗子专和等位性分析表明 它们都只含有一对显性恢复荃因，三恢复系中恢复基因彼此间互不等 位。培C3 11与密阳23丘。」f内遗传交换率为7.29;在密阳23不!」9311}、、」 的遗传交换率为11.43:而()311不1一!培C31】问的遗传交换率为2().37。 对培C31】·「一扫的恢复摧因位点与SSR分子标记之间的连锁关系分析发 现，引物RM6704一!只在不育群体l一卜有一个交换株，与恢艾基因的遗传 距离为2.OeM;，〕1物I之M6704一2、RM5629、RM171所检测到的交换株 分别为2株、3株、4株，遗传距离依次为4.IcM、6.IcM和8，ZcM; 根据恢复位点一与SSR分子标记问的遗传距离以及交换单株的不1司，将 恢复基因位点定位于染色体长臂，位于RM6704一l和RM6704一2卜游。 4.以野败型不育系珍汕97A和红莲型不育系粤泰A作母本分别 与野生稻测恢，探讨野生稻中恢复基因的分布。试验发现，在35份野 生稻中，有22份检测到恢莲型恢复葵因;而在测恢的31个野z!:.稻生 态型中有16份检测到野败型恢复基因，红莲型恢复基因的分布频率高 于野败型。对比红莲和野败的可恢复性，发现恢复基因的分布具有如 下特点:(l)除a/(; ngi“aojllicll“没有测恢外，其它6个种均有恢复基 因分布，但绝大部分集“一}，在().，·砚肠，o即n不l}0.nivara两个种。(2)0. ruf加ogon和0 niva阳大部分可同时恢复两利，不育类型，但个别的例外。 (3)同一生态型中的恢复基因对两种不育细胞质类型的可恢复强度也 不一致，强恢复源主要存在于野生稻0.oivara中，而口.r咖090。’4一” 含强恢复基因的生态型较少。遗传分析表明，