CYP2E1介导异烟肼肝毒作用机制及其有效干预措施研究

【摘要】：异烟肼(isoniazid，INH)是化学预防和治疗结核病的主要药物，具有疗效高、口服方便、价廉等优点。但临床资料显示INH可引起20％左右的病人出现肝功能改变，其中1-2％患者因严重肝损伤而导致死亡。INH肝毒作用及其机制虽已有近30年的研究，但对其认识目前仍不十分清楚。对于INH引起肝损伤的病人，目前临床上缺乏特异性有效治疗方案致使病程延误。 在CYP亚型中，CYP2E1主要代谢小分子化合物，在肝脏毒理学方面有重要意义。CYP2E1的多种底物为前毒物，经其代谢后产生肝毒效应，同时这些底物也可调控CYP2E1的表达。INH为CYP2E1诱导剂，但其肝毒作用与CYP2E1之间的关系未见文献报道。利福平(rifampicin，RFP)常与INH合用治疗结核病，有观点认为RFP诱导细胞色素P450，从而加重INH肝毒性，但参与肝毒性的CYP亚型不清。 本文从药物代谢角度出发，采用体内、体外研究方法，从整体水平到分子水平深入研究INH肝毒性及其机制，以及RFP对INH肝毒作用影响。这些问题的阐明无疑在理论上和实践上均有重大意义及价值。此外，本课题还进一步研究特异性干预INH肝毒性的有效措施，并探讨其机理。全文共分三部分。 一、建立RP-HPLC测定INH毒性代谢产物肼血液浓度的方法学。采用反相C_(18)柱，以5 mmol·L~(-1)醋酸钠(用1 mol·L~(-1)冰醋酸调节pH至5.0)—乙腈(35：65)为流动相，检测波长300 nm。样品经丙醇预处理，与衍生试剂3-甲氧基苯甲醛、甲酸、9-芴酮在室温条件下于黑暗处反应3 h后，作HPLC分析。肼衍生物保留时间为3.487分钟，在8.5～85.2μmol·L~(-1)浓度范围内，线性关系良好(r=0.999)，平均回收率为100.2％，日内、日间RSD均小于2％。结果表明本方法准确并较为简便。 二、研究CYP2E1在介导INH所致肝毒性中的作用；探讨INH肝毒作用机制；并用利福平(RFP)对INH肝毒作用的影响特征。♂大鼠，单用INH(100 mg·kg~(-1)，ip)或合用RFP(100 mg·kg~(-1)，ig)，10 d或21 d，以sALT、sAST和肝脏指数为肝 毒指标。在生物转化1相反应中，采用肝微粒体7一乙氧基异嗯哇O一脱乙基酶 (EROD)、苯胺轻化酶(ANH)与红霉素N一脱甲基酶(ERD)分别测定 CYPIAI、CYPZEI与CY’P3A水平的变化。在生物转化n相反应中，以1一氯一2，4一二硝 基苯(CDNB)、利尿酸(EA)、过氧化异丙基苯(CP)和磺澳酞钠(BSP)为底 物，测定肝细胞胞浆sGST、aGST、·林GST和兀GST活性;以7一轻一4一甲基香豆素、对 轻基联苯为底物，测定肝微粒体UDPGT亚型活性，以观察INH对H相结合反应的影 响。半定量RT一PCR测定肝CYPZEI、CYP3AI mRNA表达水平;RP一HPLC测定 INH代谢物血浆腆浓度;并进行相关性分析。 由结果可见:①单用INH处理10d，与对照组相比，sALT、SAST以及肝脏指 数无显著差异，肝微粒体CYPZEI水平增加2.7倍(尸0.01);合并应用即P10 d，未见明显肝功能改变，而CYPZEI水平较单用INH下降13%(P0.05)，胁血 浓下降19%。②单用INH 21d，与对照组相比，sALT、肝脏指数分别升高29%和 21%，表明出现肝损害，同时CYPZEI水平进一步增加，达对照组4.6倍(P 0，01)，腆血浓升至10 d INH组的1.7倍，并且胞浆sGST、aGST、林GST、兀GST较 对照组分别下降21%，39%，40%，39%;而并用RFP 21d后，肝毒作用与单用 INH 2 ld相似，但CYPZEI水平较单用INH Zld下降24%(P0.05)，并且胞浆 sGST、aGsT、林GST、笼GST‘较单用INH 21d分别升高14%，9%，64%，32%。 ③单用INH及并用即P 10d或21d，肝微粒体CYP3A与UDPGT亚型水平均与对照 组无显著差异。④相关性分析表明，单用INH时，sALT变化与血浆脐水平有明显正 相关(:二住6%，尸0.05)，同时肝CYPZEI水平与脐血浓有良好相关性(:二 0.626，P0.05)，并且sALT变化与CYPZEI水平呈明显正相关(:=0.904，尸 0.01)。⑤单用INH及并用RFP Zld，肝CYPZEI、CYP3AlmRNA表达水平均与对 照组无显著差异。 实验结果表明，INH肝毒作用与其代谢产物脐的血浓有关，进一步证实脐为INH 毒性代谢产物;CYPZEI一方面为血脐所诱导，同时又介导了腆所致肝毒作用。盯P 与INH短期合用，不明显加重肝毒，其机制与其下调CYPZEI的作用有关。 三、在上述研究基础上(CYPZEI介导刀叮H肝毒性)，本部分从已上市药物中遴 选抑制CYPZEI活性的药物，对刀又H肝毒效应进行机理性干预，并阐明作用机制。 体外实验，以ANH为CYPZEI标志酶，研究硫宁(即N)对CYPZEI的抑制作用， 半对数线性回归计算IC50，经Lieweaver一Burk双倒数作图法判断抑制类型，采用 Dixon作图法计算Ki值。体内实验，研究TPN对取H肝毒效应的影响。取占Wistar 大鼠，分组为:①空白对照组(10d);②取H组(100 mg.kg一‘X 10d，切);③INH 与T即合用组闭呵Hloomg·kg一，x一od，iP;TpN6omg·kg一，Xlod，iP);④空白对 照组(21d);⑤取H组(一00 mg·kg一，xZld，iP);⑥取H与T即合用组印呵H 100 mg·kg一‘X21d，iP;T即60 mg·kg一，xlld，iP)，T即于给予取H第11d起合用。 以sALT、sAST、肝脏指数为肝毒指标;以肝微粒体ANH和氯哇沙宗6一轻化酶 (CZXH)活性(RP一HPLC法)反映CYPZEI活性;以1一氯一2，4一二硝基苯 (CDNB)、利尿酸(EA)、过氧化异丙基苯