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犬自体骨髓干细胞移植修复受损心肌的实验研究

张澍  
【摘要】:心血管疾病因其发病率不断增高,而病因、发病机制又不甚清楚,故严重危害人类健康。而慢性充血性心力衰竭(CHF)是上述各种心血管疾病的共同转归或死亡原因。尽管人类心脏中存在着多种修复机制,但是它不能完全阻止病理过程的进展及恶化,而临床上也缺乏其根本性治疗手段,故CHF仍然是一个亟待解决的临床问题。由于越来越多的证据表明在动物或人体内骨髓干细胞,例如间充质干细胞,可以产生新的心肌细胞,所以利用骨髓干细胞移植为心肌梗死(心梗)的恢复和预防心梗及其它原因导致的CHF提供了一个很有希望的治疗策略。本研究就是通过为急性心梗模型犬移植自体骨髓间质干细胞以观察这种治疗方法的疗效。整个研究分以下四个部分。 第一部分:犬自体骨髓干细胞的体外分离、增殖、分化和鉴定 目的:验证骨髓间质干细胞在体外能否分化为包括心肌细胞在内的其他多种细胞。实验方法:抽取犬骨髓液10mL,应用DMEM以1:1稀释骨髓液,用1.063g/ml percoll密度分离液,以600g离心力,30分钟分离骨髓单核细胞;以LG-DMEM及10%FBS添加100 U/ml penicillin,100μg/ml streptomycin,and 25μtg/ml amphotericin B培养骨髓干细胞;利用细胞贴壁筛选法分离培养、扩增骨髓间叶干细胞;应用干细胞表面标志蛋白检测,诱导剂诱导分化间叶组织细胞等方法进行犬骨髓间叶干细胞的鉴定。结果:分离出的犬骨髓单核细胞约占细胞总数的10~(-4)~10~(-6),在LG-DMEM与选择性血清培养基上生长良好。犬骨髓间叶干细胞孵育24小时即可见细胞贴壁生长,贴壁细胞约占接种单核细胞总数的10~(-6)。犬骨髓间叶干细胞增殖分裂迅速,36~48小时内增殖多个细胞,约72小时即可增殖形成大的细胞克隆,7~10天即可布满瓶底。细胞融合时类似成纤维细胞,呈纺锤状,细胞小而密集,螺旋梳状排列。连续培育10代以上,未见细胞形态、增殖特性发生改变。未见骨髓干细胞自发分化其他类型细胞,仍维持原发培养细胞的增殖特性。犬骨髓间叶干细胞的表面标志SH2阳性,而CD45则阴性。在化学诱导液的作用下,犬骨髓间叶干细胞能够定向分化为心肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞等多种间叶组织类型细胞。其中应用10-20μmol/L的化学诱导剂5—氮胞苷孵育早期培养的骨髓间叶干细胞3~4周,可使细胞形态转为肌细胞,形成肌管;肌细胞特异性蛋白α-actin,α-actinin,Myosin以及心肌细胞特异性分子标志 Troponinl免疫组化染色阳性;透射电镜见分化细胞呈梭形,细胞核呈卵圆形, 位于细胞中央,可见肌小节、肌丝与糖原颗粒。检测表明经5一氮胞普诱导分化 的骨髓间叶干细胞己具备典型心肌细胞结构。结论:密度梯度分离法与贴壁筛选 法能够较好进行犬骨髓间叶干细胞的体外分离、培养与扩增,分离培养的细胞具 备骨髓间叶干细胞的特性,并可以定向分化为心肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞等 多种间叶组织类型细胞。 第二部分:犬急性心肌梗死模型的制备和评价 以及经冠状动脉移植骨髓干细胞 目的:制备急性心肌梗死模型犬,并进行临床评价。同时经冠状动脉(冠脉) 进行骨髓干细胞移植。方法:20只杂种犬,随机分为两组,每组ro只,移植组 移植体外事先培养、标记好的自体骨髓干细胞;对照组移植等量细胞培养液。常 规麻醉动物,左4一5肋间开胸,暴露心脏,钝性剥离左冠脉前降支下l/3处, 穿线结扎,先结扎5分钟,放开恢复再流10分钟,重复2次,最后持续结扎60 分钟后再放开,模型制备完成。放开冠脉后1一2小时用针管从结扎处向远端冠 脉注射骨髓干细胞或细胞培养液,细胞移植完成。之后为犬行心电图和血清心肌 酶谱检测,饲养1周后再行超声心动图(UCG)和Tc嘶静息心肌灌注显像 (Tc惭一M工Bl)和’sFDG一心肌代谢显像(’SFDG一PET),以证实模型制备成功。第一 次临床检测完成后,送标准饲养厂饲养8一10周,以待第二次临床检测。结果: 模型制备完成后48小时整个胸前导联Vl一V6和肢导联I、aVL QRS综合波振幅 减小,呈病理性QS波,T波倒置;模型制备完成后9一12小时查血清心肌酶谱: 肌酸磷酸激酶(CK)平均4998.6士198.4 IU/L,其同工酶(CK一B)平均423.7 士67.9工U/L;饲养1周后UCG示:模型动物前壁呈节段性运动障碍,左心室射 血分数(LVEF)下降,对照组平均为55.4%士13.6%,移植组平均为49.8%士10.8%, 经统计学检验,两组间LVEF差异无显著性(P0 .05):Tcg腼一M工BI示:心尖部、 左室前壁及室间隔明显充盈缺损;‘SFDG一PET示:心尖部、前壁近心尖部及前壁 中段无放射性充填,间隔有部分充填。结果表明犬急性广泛前壁心梗模型制备成 功。 第三部分: 目的:评价实验动物在饲养 在体移植疗效临床评价 8一10周后的存活率、心功能及心肌代谢显像。 方法:模型动物在接受移植后饲养8一10周,再次麻醉,对其进行第二次临床检 测,包括:超声心动图(UCG)、Tc蜘静息心肌灌注显像(Tcg骊一M工BI)和’SFDG一 心肌代谢显像(’SFDG一PET)。结果:l、对照组10只动物在术后1周内死亡5只, 仅存活5只接受了第二次临床检测,死亡率为50%。而干细胞移植组10只动物, 有9只存活,仅1只死亡,死亡率10%,经卡方检验,两组间死亡率差异有统计 学意


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