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《武汉大学》 2004年
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诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

钱海燕  
【摘要】:目的 分别使用布法罗大鼠肝细胞(Buffalo rats liver,BRL)条件培养基、鼠胚成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)饲养层体外培养胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs),并使用不同分化诱导物对ESCs分化为心肌细胞施加影响,以筛选理想的高效定向培养及分化方案。 方法 分别用BRL条件培养基和MEF饲养层两种培养方法培养ESCs,以抑制ESCs分化并保持其增殖。当ESCs增殖到足够数量时撤除MEF饲养层和BRL条件培养基,以维甲酸(retinoic acid,RA,2nmol/L)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,0.6%)、转化生长因子β_1(transforming growth factor-β_1,TGF-β_1,2ng/ml)、激活素-A(activin-A,20ng/ml)为分化诱导剂加入分化培养基中,组合成六种分化培养基,分别为无诱导物组、TGF β_1组、activin-A组、RA+DMSO组、TGFβ_1+DMSO组、TGF β_1+activin-A组,采用悬滴、悬浮、贴壁三步法诱导ESCs分化为心肌细胞。经光镜观察、透射电镜分析及免疫细胞化学染色,以出现自发性收缩活动且心肌细胞特异结构蛋白免疫染色阳性的悬滴计为分化成功。计数各组分化成功的悬滴数,计量资料以x±s表示,组间比较用方差分析及t检验,以P<0.05为差异有显著性,比较各组分化比率。 结果 (1) BRL条件培养基及MEF饲养层两种培养方法均能促进ESCs增殖并抑制其分化,ESCs呈巢状集落生长。(2) 六组分化诱导条件均能使ESCs分化为心肌细胞,以MEF饲养层法培养和BRL条件培养法培养的ESCs在六组分化诱导物作用下分化比率分别为无诱导物组(23.1±2.58% vs 30.5±1.29%)、TGF-β_1组(61.2±3.21% vs 68.5±2.65%)、activin-A组(58.5±2.26% vs 65.3±1.71%)、RA+DMSO组(62.8±3.97% vs 70.8±2.71%)、TGF-β_1+DMSO组(71.2±3.96% vs 76.0±2.94%)、TGFβ_1+activin-A组(81.8±4.06% vs 92.8±2.22%)。(3) 以BRL条件培养法培养的ESCs在六组分化比率均显著高于MEF饲养层法(P<0.01);在六种诱导条件之间比较,以TGF-β_1+activin-A组的分化率最高(P<0.001)。 结论 以BRL条件培养基培养,TGF-β_1+activin-A组合是一种理想的ESCs体外分化体系。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R329.2

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