工程单纯疱疹病毒靶向性癌症基因治疗研究
【摘要】：肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病。肿瘤的发生与防治研究过去是、现在是、并在将来一定时期内仍将是生命科学研究的热点。现在的治疗方法首选手术切除，配合放疗化疗，但放疗化疗有严重副作用。因此，研究肿瘤发生与发展的分子机制，探索肿瘤基因治疗的新技术、新方法，具有十分重要的意义。
二十世纪九十年代，随着分子生物学、肿瘤学及病毒学本身的发展，肿瘤发生的分子机制，细胞与病毒间的作用机制，信号传导通路，凋亡抑制与诱发机制等逐渐被阐明，用病毒治疗肿瘤成为研究的热点。这种能选择性地在肿瘤细胞中复制，并进一步杀灭肿块，被称为条件性复制病毒或选择性复制病毒(conditional replicative viruses)，或溶瘤病毒(oncolytic viruses)。
本室肖庚富和兰萍博士构建的缺失凋亡抑制基因icp34.5的单纯疱疹病毒(mtHSV)就是一种有靶向性的溶瘤病毒。本实验研究了mtHSV在体外和体内的选择性杀瘤效应。
研究了mtHSV对2种人正常细胞和6种人肿瘤细胞的体外效应。我们发现它能选择性地在多种人癌细胞中复制，对人神经胶质瘤U251细胞、人膀胱
癌EJ细胞、人肝癌H即一3B细胞、人喉癌H即一2细胞等杀伤效率较高，对
人肺腺癌AS续9细胞、人肺癌SPC一A1细胞作用不显著，而对人成纤维细胞(MRC
一5)和人羊膜细胞(WISh)几乎无影响。
选择了人肝癌细胞Hep一3B作为裸鼠荷瘤细胞株，成功构建了荷人肝癌
Hep一3B的裸鼠模型。将125头荷瘤裸鼠分为5组进行治疗，高，中，低3个
mtHSV治疗组，l个空白对照组，1个临床药物(阿霉素)对照组。治疗采用
瘤内注射，每周1次，共3次，在治疗过程中，隔日测量肿瘤大小，裸鼠体重，
观察其生活状态。从第3次治疗后一个星期开始分三批(每周一批)处死裸
鼠，眼球取血后，做血常规以及血液生化检查;将其肿瘤，心，肝，脾，肺，肾和大
脑分别取材测量重量后，分别做RT一PCR检测，病理切片等。实验结果显示，
治疗组有效率达100%，治愈率达到21.5%，动物生活状态良好，无死亡;
阿霉素对照组动物出现毒副反应和死亡，空白荷瘤组裸鼠生活状态极差，死
亡率达29.17%;以高浓度mtHSV计算，生存期比空白对照组延长11 .5天，
肿瘤体积减少70.96%;肿瘤重量减少61.78%，PCR检测仅在被治疗裸鼠的
肿瘤中扩增出了HSV DNA带;血常规，血液生化和系统尸检等结果表明IntHSV
对治疗裸鼠基本无副作用。
以上结果充分表明，mtl王SV能靶向性和选择性地杀死肿瘤细胞，对正常
细胞和组织安全，是一种很有前途的癌症基因治疗药物。
【关键词】：基因治疗 溶瘤病毒 凋亡抑制基因icp34.5 【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R730.5
【DOI】：CNKI:CDMD:2.2004.113761
【目录】：
- 中文摘要3-5
- 英文摘要5-11
- 第一章 前言11-40
- 1 溶瘤病毒11-35
- 1.1 溶瘤病毒裂解肿瘤细胞的机制12-14
- 1.2 溶瘤病毒抗癌特异性的机制14-17
- 1.2.1 改造病毒外壳结构，使病毒亲嗜性发生改变14-15
- 1.2.2 采用双功能接头达到靶向性溶瘤的效果15-16
- 1.2.3 通过特异性启动子使病毒只能在肿瘤细胞内增殖16
- 1.2.4 通过缺失病毒的某一种基因构建靶向性溶瘤病毒16-17
- 1.3 常见的几种溶瘤病毒17-33
- 1.3.1 单纯疱疹病毒17-27
- 1.3.2 腺病毒27-30
- 1.3.3 人呼肠孤病毒30-32
- 1.3.4 细小病毒32
- 1.3.5 新城疫病毒32-33
- 1.4 结语33-35
- 2 本实验研究背景及目的35-40
- 2.1 研究背景35-38
- 2.2 研究目的38-40
- 第二章 研究方法40-58
- 1 基因克隆技术40-46
- 1.1 质粒DNA的制备40-42
- 1.2 限制性酶消化42
- 1.3 DNA片段回收42-44
- 1.4 DNA片段及载体的连接44
- 1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)44-45
- 1.6 质粒DNA的转化45-46
- 1.7 菌种的甘油保存46
- 2 细胞培养46-49
- 2.1 细胞培养基的配制46-47
- 2.2 细胞传代培养47
- 2.3 细胞的冻存与复苏47-48
- 2.4 细胞计数48-49
- 3 病毒的增殖49-51
- 3.1 细胞转染49-50
- 3.2 病毒的扩增50
- 3.3 病毒粒子的纯化50
- 3.4 空斑试验50-51
- 4 核蛋白质的抽提51-53
- 5 蛋白的原核表达及纯化53-55
- 5.1 pET28原核系统的表达53-54
- 5.2 Ni~(2+)亲和层析法纯化蛋白54-55
- 6 实验中所用到的溶液及试剂55-58
- 第三章 mtHSV的体外选择性杀瘤效应研究58-67
- 引言58-59
- 1 材料与方法59-60
- 1.1 细胞与实验动物59-60
- 1.2 病毒在肿瘤细胞中的复制效率60
- 1.3 病毒对肿瘤细胞的感染60
- 2 结果60-63
- 2.1 mtHSV在人肿瘤细胞中的选择性复制60-61
- 2.2 mtHSV对肿瘤细胞的靶向性杀伤效率61-63
- 3 讨论63-67
- 3.1 突变型单纯疱疹病毒的安全性63-65
- 3.2 突变型单纯疱疹病毒的靶向性杀瘤作用65-67
- 第四章 mtHSV对荷人肝癌Hep-3B裸鼠的治疗67-96
- 引言68-69
- 1 材料与方法69-75
- 1.1 细胞与实验动物69-70
- 1.2 Hep-3B细胞的大量培养及浓缩70-71
- 1.3 建立荷瘤裸鼠模型71
- 1.4 mtHSV的制备和保存71-72
- 1.5 mtHSV对荷Hep-3b裸鼠的治疗72
- 1.6 裸鼠各组织总RNA的提取和RT-PCR72-74
- 1.7 血液学指标检测74
- 1.8 血液生化指标检测74
- 1.9 系统尸检及病理组织学检查74-75
- 1.10 统计学分析75
- 2 结果75-92
- 2.1 荷人瘤Hep-3B裸鼠模型的建立75-76
- 2.2 mtHSV的抑瘤效应76-83
- 2.2.1 各治疗组裸鼠与空白对照组裸鼠外观比较76-78
- 2.2.2 mtHSV治疗组裸鼠肿瘤与对照组裸鼠肿瘤解剖后比较78
- 2.2.3 mtHSV对荷Hep-3B裸鼠在体肿瘤生长的抑制78-81
- 2.2.4 mtHSV对荷Hep-3B裸鼠肿瘤的抑制作用总结81-83
- 2.3 RT-PCR产物的电泳检测83-85
- 2.3.1 以pol基因作为引物的RT-PCR产物的电泳检测83-84
- 2.3.2 以tk基因作为引物的RT-PCR产物的电泳检测84-85
- 2.4 血液学指标检测结果85-86
- 2.5 血液生化指标检测结果86-88
- 2.6 系统尸检结果88-90
- 2.7 病理组织学检查结果90-92
- 3 讨论92-96
- 3.1 mtHSV治疗荷人瘤裸鼠的有效性和安全性92-93
- 3.2 mtHSV靶向性溶癌的理论基础93
- 3.3 展望93-96
- 参考文献96-106
- 硕士期间发表和待发表的论文106-107
- 致谢107-108
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