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《武汉大学》 2005年
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多药耐药基因MDR1短发夹状RNA表达质粒的构建与鉴定

胡礼仪  
【摘要】:目的:RNA干扰是一种双链RNA进入细胞内而使特异基因表达抑制的进化保守的转录后基因沉默现象,目前RNA干扰已成为研究基因功能的重要方法。本研究旨在利用DNA载体在细胞内产生短发夹状RNA,来诱导RNA干扰。本研究构建含多药耐药基因MDR1的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,并观察其对肝癌耐药细胞Bel-7402/R的MDR1 mRNA的抑制作用。同时也为RNA干扰研究基因功能建立技术平台。 方法:根据Genebank中的MDR-1mRNA设计的两条反向重复多聚核苷酸序列,退火形成双链DNA,利用分子克隆技术,将含MDR-1的双链DNA,与经双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshRNA-MDR1重组质粒,通过聚合酶链反应(PCR)和DNA测序证实了表达质粒构建成功;在脂质体的介导下转染肝癌耐药细胞株BEL-7402/R,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析MDR-1 mRNA的表达,MTT法检测细胞对药物的敏感性,流式细胞仪(FCM)检测细胞内罗丹明123(Rh123)的潴留和P-gP的表达。 结果:PCR和DNA测序证实了含多药耐药基因MDR-1的短发夹状RNA表达质粒构建成功,转染肝癌耐药细胞Bel-7402/R后能明显地抑制其MDR-1 mRNA的表达,P0.05;对阿霉素和顺铂的半数抑制率IC_(50)明显降低,P0.05;P-gP的表达阳性率降低了57.3%;细胞内Rh123的浓度显著增高,P0.05。 结论:成功地构建了重组质粒pshRNA-MDR1,该质粒能有效地降低肝癌耐药细胞MDR-1 mRNA的表达,有望消除P-gP的作用,为逆转其引起的MDR的基因治疗提供实验基础,开创一条新途径。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:R73-3

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