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松毛虫T4病毒的分离及其分子生物学特性的研究

易福明  
【摘要】:我们在松毛虫病毒的资源调查中从罹病的马尾松毛虫发现了一种球形二十面体病毒粒子,它不同于已经报道的松毛虫病毒中的任何一种。通过对这种新的病毒的理化性质、血清学以及基因组核苷酸全序列分析,我们确定该病毒是T4病毒科松天蛾ω类似病毒属的一个新成员,且暂时将其命名为松毛虫T4病毒(Dendvolimus puncfatus tetravirus,DpTV)。 通过匀浆、差异离心、蔗糖密度梯度离心、氯化铯等密度离心等方法,我们最终分离获得了高浓度的病毒离子,其在氯化铯中的浮力密度为1.281g/ml。负染电镜观察,病毒粒子为均一的二十面体球形结构,直径约为40 nm。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明DpTV的壳蛋白组成与NωV(Nudaureliaωvirus)非常相似,也是含两种壳蛋白,分子量约为62,500 Da和6,800 Da。DNase Ⅰ和RNaseA消化实验以及变性琼脂糖凝胶电泳结果显示,DpTV基因组由两条单链RNA分子组成(RNA1和RNA2),大小分别为5.5kb和2.5kb。DpTV的这些理化特性都符合T4病毒科松天蛾ω类似病毒属的分类特征。免疫分析表明DpTV和NωV之间具有抗原关系,说明这两者之间的亲缘关系较为密切,进一步证明了DpTV是T4病毒科松天蛾ω类似病毒属的一个新成员的分类地位。 为了了解DpTV的基因组结构以及从分子水平上对该病毒进行分类鉴定,我们提取了DpTV基因组RNA,采用随机引物合成cDNA,RT—PCR以及3’、5’RACE等方法测定了DpTV RNA1和RNA2的全核苷酸序列(Genbank编号:RNA1,AY594352;RNA2,AY594353)。RNA1的核苷酸序列共计5492个核苷酸,其中G+C含量为57.3%;RNA2的核苷酸序列共计2490个核苷酸,其中G+C含量为55.9%。DpTV基因组RNA 3’端没有poly(A)尾,而是由一个—CCA(-CCA box)盒取代。二级结构分析表明,DpTV基因组RNA3’端的核苷酸可以折叠成类似tRNA的二级结构,该tRNA类似结构不含植物病毒所具有的假结。序列分析表明DpTV RNA1有一个大的开放阅读框(open reading frame,ORF),该ORF起始于第一个起始密度码子AUG(nt 37—39),终止密码子为UGA(nt4984-4986),编码一个含1649个氨基酸残基,分子量为179,474Da的蛋白质(p180),等电点为8.10。DpTV RNA1的核苷酸序列比HaSV(Helicoverpa


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