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苯并咪唑对G四链体的调控和抗癌活性研究及可视化方法检测G四链体

黄静  
【摘要】:富含G碱基的序列可以通过Hoogsteen氢键形成四聚结构,即G-四链体。这些富含G的序列在基因组中广泛存在,包括端粒区、基因启动子区、内含子区等等。许多报道指出,一些小分子可以通过稳定G-四链体来抑制端粒酶活性或基因表达而成为一种靶向G-四链体的抗癌药物。 基于G-四链体的生物学功能,我们设计了一类苯并咪唑衍生物,对它们与G-四链体的相互作用进行了研究,并探讨了它们作为抗肿瘤药物的活性。同时鉴于稳定G-四链体的配体分子在研发抗癌新药中的重要性,建立有效可靠的检测G-四链体及其配体分子的方法也显得至关重要。我们建立了一种以聚集发光(AIE)分子噻咯(silole 1)来检测体系中G-四链体结构和G-四链体配体分子存在的方法。具体研究内容涵盖以下几点: 1.首先在体外实验中,我们对苯并咪唑衍生物与G-四链体以及双链DNA的相互作用进行了研究。使用圆二色光谱法、核酸外切酶Ⅰ法、聚合酶中止法、紫外滴定、热力学参数分析等实验手段证明了苯并咪唑化合物1与双链DNA有着很好的结合,而化合物2-4对G-四链体有着特异性结合,并随着化合物支链取代的不同,能诱导出不同拓扑异构的G-四链体构型。在端粒酶抑制试验中,我们发现这些对G-四链体有着特异性结合的苯并咪唑化合物有着很好的抑制端粒酶活性。我们对这类化合物结合G-四链体的构效差异进行了分析,分子的计算机结构优化结果表明苯并咪唑化合物母环的平面性是结合G-四链体的决定性因素,而不同构型G-四链体的形成则归因于它们侧链取代基位置的不同。 2.我们进一步对此类苯并咪唑化合物的抗癌活性进行了研究。我们用MTT法对药物的细胞毒性进行了研究,并研究了化合物对癌细胞生长周期的影响。细胞毒性实验表明能够稳定诱导G-四链体的化合物对胃癌细胞SGC7901和宫颈癌细胞Hela的毒性都非常明显,而不能作用于G-四链体的化合物细胞毒性相对较弱。免疫荧光实验的结果表明,化合物对癌细胞的杀伤力主要是通过DNA损伤起作用。更重要的是,这些DNA损伤跟端粒有关。此外,研究发现作为G-四链体配体分子的苯并咪唑化合物抑制了原癌基因c-myc的表达。所有实验结果表明苯并咪唑化合物对癌细胞的抑制作用都与G-四链体有着密切的关系。 3.最后,本论文建立了一种用AIE分子silole 1可视化检测水解酶体系中G-四链体结构的方法,并能成功应用于检测G-四链体配体分子的存在。它不仅能检测多种不同序列的分子内G-四链体(如端粒,c-myc,c-kit和VEGF等)而且也能检测分子间的G-四链体(如Na+诱导的d(G4T4G4)。我们选用了四阳离子卟啉TMPyP4和苯并咪唑化合物5(BBP)作为研究对象,用该方法检测小分子诱导稳定G-四链体的情况。在没有任何金属离子条件下,TMPyP4不能诱导端粒序列形成G-四链体结构,化合物5能诱导形成G-四链体结构。利用该方法检测出的结果与之前文献报道的一致。该方法有可能应用到快速筛选各种G-四链体配体分子试剂盒的研制中。


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