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抗猪瘟嵌合DNA疫苗及TRIF的DNA疫苗佐剂效应研究

万超  
【摘要】: 猪瘟(classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的、猪的一种高度致死性传染病,在世界许多国家和地区广泛流行,在国际兽医局制定的《国际动物卫生法典》中,猪瘟被列入A类16种法定传染病之一。我国也作为Ⅰ类动物疫病加以重点控制。自50年代以来,我国自行研制的猪瘟兔化弱毒疫苗(“C”株)的广泛应用,在控制猪瘟的爆发流行中发挥了重要作用。然而,猪瘟兔化弱毒疫苗五十多年的长期使用,并未能有效控制猪瘟的发生和传播。近年来,我国猪瘟发生呈明显上升态势,并出现诸如散发流行、慢性猪瘟、持续感染和妊娠母猪带毒综合征等新特点。病毒逃避机体的免疫清除和在猪体内局部的持续存留;疫苗制品质量问题;运输和保存不当导致疫苗效力降低或失效;以及疫苗株毒力的回复突变等是其主要原因。因此,在欧美一些国家已明确禁止使用猪瘟弱毒活疫苗接种。我国是养猪大国,猪瘟的发生和流行,是制约农村养猪业发展的瓶颈。为满足对猪瘟预防、控制和最终根除的需要,研制新一代抗猪瘟疫苗制品以替代传统猪瘟兔化弱毒疫苗,势在必行。 本研究在对猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2和Erns保护性抗原区域结构分析的基础上,利用RT-PCR技术,以猪瘟病毒石门(Shimen)株基因组RNA为模板,扩增E2和Erns抗原编码区序列,与组织纤溶酶原激活剂(tPA)信号肽cDNA序列融合,克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒ptPAs/△E2/△Erns和ptPAs/△E2,以及使用E2信号肽构建pE2s/△E2/△Erns和pE2s/E2。转染PK15细胞,检测目的基因的表达。 用所构建的重组质粒免疫BALB/c雌性小鼠,免疫3次,每次间隔2周,设pcDNA3.1(+)及PBS阴性对照,第三次免疫2周后采血,分离血清。分别以原核表达并纯化的E2或Erns蛋白为包被抗原,间接ELISA方法检测血清抗体水平;以纯化的E2或Erns蛋白为刺激原,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况;以猪瘟病毒Shimen株或刀豆蛋白A(ConcanavalinA, ConA)为刺激原,Elispot法检测IFN-y分泌情况。结果表明,除pcDNA3.1(+)和PBS对照组外,各重组质粒免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,与对照组相比差异显著(p0.05)。融合tPA信号肽DNA疫苗免疫组的血清OD492nm值与E2信号肽DNA疫苗免疫组相比差异显著(P0.05)。猪瘟病毒Shimen株或E2或Ems蛋白刺激后,嵌合E2和Erns基因DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-y和T细胞增殖效果高于单价DNA疫苗组(p0.05),含有tPA信号肽组高于E2自然信号肽组,融合E2和Erns的ptPAs/△E2/△Erns和pE2s/△E2/△Erns组要优于只含有E2的单基因组。以上结果表明,在诱导免疫应答方面嵌合DNA疫苗要优于单价DNA疫苗,tPA信号肽组优于E2信号肽组。 在小鼠实验的基础上,选取诱导免疫效果较好的ptPAs/△E2/△Erns免疫CSFV血清抗体阴性猪,pE2s/E2和pcDNA3.1(+)同时免疫作为对照,免疫3次,每次间隔2周,第三次免疫2周后,以105TCID50剂量的CSFV Shimen强毒株经肌肉注射途径攻击。观察猪体临床症状,记录猪体体温。并分别在攻毒后第0、4、8、12天后采血分离血清,以及采集鼻拭子和频死猪组织样品。中和试验检测血清中和抗体水平,间接ELISA检测血清抗体IgG水平,RT-PCR检测猪瘟病毒在组织样品和血清样品中复制情况等。结果表明,嵌合DNA疫苗免疫后产生的血清中和抗体水平、白细胞数量明显高于非融合DNA疫苗,pcDNA3.1(+)对照组攻毒后实验猪全部死亡,pE2s/E2免疫组部分猪死亡,而ptPAs/△E2/△Erns免疫组全部猪存活,说明具有tPA信号肽的嵌合DNA疫苗ptPAs/△E2/△Erns具有针对猪瘟病毒完全的免疫保护效果,而E2信号肽单基因DNA疫苗pE2s/E2只具有针对猪瘟病毒部分的免疫保护。 在此研究基础上,以p干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)作为分子佐剂和重组质粒ptPAs/△E2/△Erns或pE2s/E2同时免疫BALB/c雌性小鼠,免疫3次,每次间隔2周。第三次免疫2周后采血分离血清,分别以原核表达E2或Erns为包被抗原,间接ELISA方法检测血清抗体水平;以猪瘟病毒Shimen株或刀豆蛋白A(ConcanavalinA, ConA)为刺激原,Elispot法检测IFN-γ分泌情况。结果表明,重组质粒ptPAs/△E2/△Erns或pE2s/E2与TRIF同时免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,但与非佐剂组相比差异不显著(P0.05)。猪瘟病毒Shimen株刺激后,TRIF和DNA疫苗共免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-γ数量明显高于非佐剂DNA疫苗组(p0.05)。以上结果表明,TRIF共免疫可显著增强DNA疫苗诱导细胞免疫水平。 以重组质粒ptPAs/△E2/△Erns和TRIF、pE2s/E2和TRIF免疫CSFV血清抗体阴性猪,免疫3次,每次间隔2周,第三次免疫2周后,以105TCID50剂量的CSFVShimen强毒株经肌肉注射途径攻击。分别于攻毒后第0、4、8、12天采血分离血清,中和试验检测血清中和抗体水平,间接ELISA检测血清抗体IgG水平,RT-PCR检测组织样品中CSFV分布、计算白细胞数量,观察猪体临床症状并记录猪体体温变化情况等。结果表明,ptPAs/△E2/△Erns和TRIF、pE2s/E2和TRIF共免疫DNA疫苗猪强毒攻毒后,白细胞数量明显高于非佐剂DNA疫苗,血清中和抗体水平与非佐剂组无明显差异,但DNA疫苗共免疫TRIF佐剂组猪只全部存活,说明TRIF能提高DNA疫苗的免疫效果,并诱导具有针对CSFV强毒株攻击的完全免疫保护。 综上所述,本文首次构建了由CSFV主要抗原E2和Erns编码基因融合组成的抗猪瘟嵌合DNA疫苗,并对其在机体内诱导免疫效力进行了研究。在此基础上,研究了细胞通路信号分子TRIF共免疫对DNA疫苗免疫保护效果的影响。初步证实了抗猪瘟嵌合DNA疫苗可以诱导猪体增强的抵抗CSFV强毒株致死攻击的免疫保护,TRIF可显著提高DNA疫苗的细胞免疫应答和抗病毒作用,这些工作为新型抗猪瘟DNA疫苗的研制奠定了坚实的基础。


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