收藏本站
《武汉大学》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

慢病毒介导的Lefty-A RNA干扰对TGF-β诱导HK-2细胞发生EMT转化的影响

林亮  
【摘要】: 第一部分人Lefty-A基因RNAi漫病毒载体的构建及验证 目的构建人LEFTY-A基因RNA干扰(RNAi)序列的慢病毒载体并在工具细胞(人肾小管上皮细胞HK-2)中验证其对LEFTY-A基因的敲减效率。 方法针对人LEFTY-A基因(NM 003240)设计两条RNAi序列,设计并合成其siRNA的DNA Oligo,经退火形成双链DNA后,运用T4噬菌体DNA连接酶与经Age I和EcoRI双酶切后的pGCSIL-GFP连接,转化感受态细胞。使用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增检测阳性菌落,挑选阳性克隆菌液进行测序分析。选择测序鉴定正确的克隆,抽提pGCSIL-GFP质粒(分别命名为PgcSIL1、PgcSIL2),同时抽提pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒。用Lipofectamine 2000等三种质粒共转染293T细胞进行慢病毒包装,获得的病毒浓缩液采用逐孔稀释滴度测定法进行病毒生物学滴度测定。用构建的四种LEFTY-A RNAi慢病毒载体感染HK-2细胞分别设为KD1组和KD2组,阴性对照慢病毒感染的HK-2细胞设为NC组,CON为未感染病毒的细胞组。使用RT-PCR方法检验在不同的感染复数(MOI为5或10)下两种LEFTY-A RNAi慢病毒载体的干扰效率。选择敲减效率最高的siRNA序列进行慢病毒大包装。 结果经293T细胞包装后获得两种LEFTY-A RNAi的慢病毒载体,分别命名为Pgcsill和Pgcsil2,其各自的终浓度分别是1×108TU/ml和1×108 TU/ml。RT-PCR检测结果显示,低MOI值时(MOI=5), CON组、NC组、KD1组和KD2组的2-△△Ct值分别是0.929±0.063、1.011±0.143、0.011±0.001和0.035±0.009。各KD组和NC组比较,tKD1-NC=12.16,tKD2-NC= 11.83,p值均小于0.01;各KD组和CON组比较,tKD1-CON= 25.25,tKD2-CON=24.33,p值也都小于0.01;而CON组与NC组比较,tcon-NC= 0.906,p值大于0.05,差异没有显著性。高MOI值时(MOI=10),CON组、NC组、KD1组和KD2组的2-△△Ct值分别是0.965±0.104、1.016±0.178、0.009±0.002和0.008±0.001。各KD组和NC组比较,tKD1-NC = 9.83, tKD2-NC=9.83,p值均小于0.01;各KD组和CON组比较,tKD1-CON=15.99, tKD2-CON=16.02,p值也都小于0.01;而CON组与NC组比较,tcon-NC=0.43,p值大于0.05,差异没有显著性。因此两个构建的慢病毒载体中Pgcsill在HK-2细胞上对LEFTY-A基因的表达都有非常显著的敲减效果,敲减效率均达到95%以上;Pgcsil2的敲减效率也达到90%以上。故选择Pgcsill的siRNA序列进行慢病毒大包装,包装后病毒的终浓度为1×109TU/ml。 结论本实验成功构建了LEFTY-A RNAi慢病毒载体Pscsill,能表达由CMV启动子驱动的荧光蛋白GFP,有助于帮助判断感染效率;可用来建立稳定表达LEFTY-A基因敲减的细胞株;在HK-2细胞中对LEFTY-A基因的表达有很高的敲减效率。因此该LEFTY-A RNAi慢病毒载体能够有效沉默细胞内LEFTY-A基因的表达,为进一步研究LEFTY-A基因对器官纤维化的作用奠定了基础。 第二部分LeftyA-RNAi增强TGF-β1的EMT诱导作用 目的利用LEFTY-A-RNAi慢病毒载体感染人肾小管上皮(HK-2)细胞,并探讨LEFTY-A基因表达受抑制后对其对TGF-β1刺激而发生EMT效应。 方法将实验HK-2细胞随机分成4组,TGF-β1干预组(lOng/ml, T), TGF-β1+ Pgcsill慢病毒感染组(10ng/ml,T+P), Pgcsill慢病毒感染组(Pgcsill transfection, P),单纯HK-2细胞培养组(Normal HK-2 cell line, N)。检测构建的病毒载体对该细胞LEFTY-A基因表达的敲减效率。所有Pgcsill感染组细胞均于感染36h后,换用DMEM-F12(含双抗)培养,同时给予TGF-β1 (T+P组)或同体积的无菌生理盐水(P组)进行干预。所有组分别于干预后12、24、48h收集细胞,部分提取细胞总蛋白,部分提取总RNA,-70℃保存。Western-blot法检测HK-2细胞中Lefty-A、a-SMA、CTGF蛋白的表达水平。RT-PCR法检测培养HK-2细胞中Lefty-A、a-SMA、CTGF mRNA的表达。ELISA法检测细胞上清液中Col-I的表达。 结果重组Lefty-A RNAi慢病毒载体可显著降低HK-2细胞Lefty-A mRNA和蛋白的表达。两次RT-PCR结果均显示,KD组的mRNA表达只有NC组的15%左右,实验 与NC组(1.00±0.04)和CON组(0.99±0.10)比较,KD组(0.18±0.04)Lefty-A mRNA的表达下降显著(tKD/NC=28.07, P0.01;tKD/CON= 12.70, P0.01),而NC组与CON组相比较差异无统计学意义(tCON/NC= 0.17, P0.05);实验二:与NC组(1.02±0.25)和CON组(0.91±0.14)比较,KD组(0.11±0.04) Lefty-A mRNA的表达下降显著6.19, P0.05;tKD/CON=9.57, P0.01);而NC组与CON组相比较差异无统计学意义tCON/NC=0.70, P0.05)。在各组蛋白上样量相同的条件下,KD组(0.33±0.13)Lefty-A蛋白表达只有NC组(1.82±0.18)的18%(t=11.63,P0.01);KD组蛋白表达与CON组(1.79±0.15)比较也下降显著(t=1 2.72,P0.01);而CON组与NC组比较,差异无显著性(t=0.19,P0.05)。经TGF-β1刺激12h后,正常HK-2细胞中,a-SMA蛋白几乎没有表达;T组可见胞浆中a-SMA和CTGF表达上调,但CTGF表达量的比较中P值0.05;T+P组细胞中a-SMA (P 0.05)、CTGF (P 0.05)蛋白的表达均明显升高;P组细胞两蛋白的表达与正常比较未见变化。到24h时,T组胞浆中a-SMA (P0.05)与CTGF (P0.05)蛋白表达继续上调,而T+P组的上调幅度更大,而P组蛋白表达与正常比较仍无明显变化。到48h时,T+P组胞浆中a-SMA (P0.01)和CTGF (P0.01)的表达量已远远高于T组;与P组或N组比较差异仍具有显著性意义。RT-PCR结果显示,a-SMA、CTGF mRNA的表达基本与各自蛋白表达的变化趋势 一致。P组或N组中两基因的表达在三个时间点均无明显变化。而T组和T+P组中两基因的表达均高于P组和正常对照。并随时间的延长,T+P组中a-SMA、CTGF mRNA的表达水平与T组的差异逐渐增大。ELISA检测结果显示,P组或N组HK-2细胞培养上清液中Col-I的含量基本在三个观察时间点均无明显变化。在个时间点T+P组和T组的测量值均显著高于P组或N组。而主要差异变化体现在T+P组和T组之间,随RNA干扰时间的延长,T+P组上清液中Col-I的水平与T组的差异逐渐增大。 结论构建的介导LEFTY RNAi的慢病毒载体在HK-2细胞中具有较好的干扰效果。而LEFTY-A基因表达被干扰后,HK-2细胞对TGF-β1刺激的反应显著增强,细胞表达a-SMA蛋白而发生EMT的速度明显增快。反证了Lefty-A在纤维化产生过程中的关键作用。所以,通过慢病毒载体介导的RNAi可在体外有效降低HK-2细胞LEFTY-A基因的表达,这种LEFTY-A基因和蛋白的强制低表达增强了HK-2细胞在体外对于TGF-β1刺激的反应,加快了细胞发生EMT的进程,促进了纤维化的发生。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R692.2

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 向星宇;马文丽;宋艳斌;姜茂竹;王妮莎;郑文岭;;Hsa-mir-196b慢病毒表达载体的构建及鉴定[J];热带医学杂志;2010年05期
2 曾四平;章小平;肖亚军;;Has-miR-129慢病毒表达载体的构建[J];临床合理用药杂志;2010年09期
3 郭建新;李力;白垚;程小星;邓少丽;郑秀惠;;慢病毒携带shRNA对宫颈癌细胞中HPV16型E6表达的抑制作用[J];第三军医大学学报;2006年11期
4 韩苏夏;赵晶;马瑾璐;黄辰;吕毅;欧玮;贾茜;;慢病毒介导的融合基因SP-TAT-Apoptin对HepG2细胞的作用[J];细胞与分子免疫学杂志;2010年04期
5 张彤;方天翎;李华;聂常富;蔡常洁;许赤;汪根树;李玺;易慧敏;姜楠;陈规划;;HLA-E基因慢病毒载体构建及其在肝癌HepG2细胞中的表达[J];中国实用外科杂志;2008年03期
6 杜丽丽;林戈;卢光琇;;4种全能性基因转入人胚胎成纤维细胞诱导多能性干细胞系的建立及其鉴定(英文)[J];中南大学学报(医学版);2009年12期
7 王治东;葛常辉;许望翔;詹轶群;李长燕;曹萌萌;董波;杨晓明;;慢病毒颗粒包装、浓缩及对脐带血CD34~+细胞感染[J];军事医学科学院院刊;2009年06期
8 顾卫娟;毕焕京;李建民;;HRB2基因对细胞增值影响的研究[J];现代生物医学进展;2010年09期
9 袁存存;蔡红兵;黄宇琦;叶艳芬;赵曼丽;吕晓明;李欣;;慢病毒介导的ebv-miR-BART7稳定过表达鼻咽癌细胞株CNE1的建立[J];南方医科大学学报;2011年03期
10 梁旭竞;陈小佳;陈友鹏;杨冬华;;慢病毒介导hTERT基因对肝细胞生物学特性的影响[J];细胞与分子免疫学杂志;2010年08期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 谢晶日;李明;;益气养阴活血法对胃癌前病变大鼠TGF-β1的影响[A];第二十二届全国中西医结合消化系统疾病学术会议暨消化疾病诊治进展学习班论文汇编[C];2010年
2 李丰衣;张琳;孙劲晖;田德禄;祝世功;刘霞;王庆宝;;调肝理脾方对酒精性肝纤维化大鼠转化生长因子(TGF-β1)蛋白表达的影响[A];第十二届中国科协年会22分会场——“中医药在重大公共卫生事件中的地位和作用论坛”论文集[C];2010年
3 李丰衣;张琳;孙劲晖;田德禄;祝世功;刘霞;王庆宝;;调肝理脾方对酒精性肝纤维化鼠大转化生长因子(TGF-β1)蛋白表达的影响[A];经济发展方式转变与自主创新——第十二届中国科学技术协会年会(第三卷)[C];2010年
4 许斌;;曲格列酮对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞合成纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原纤维的影响[A];2010年江苏省药学大会暨第十届江苏省药师周大会论文集[C];2010年
5 张昱;李琦;;中药灌肠对慢性肾衰竭患者肾功能及血TGF-β_1的影响[A];中国中西医结合学会养生学与康复医学专业委员会委员会议暨第七次学术研讨会论文集[C];2011年
6 尹礼烘;赵凤达;梁建萍;周荣伟;章卫华;;凉血化瘀法防治放射性肺损伤及对TGF-β_1表达的影响[A];江西省中西医结合学会第九次活血化瘀学术研讨会活血化瘀临床应用新进展培训班论文集[C];2011年
7 朱斌;朱彩凤;林宜;朱晓玲;黄陈招;鲁盈;;大黄素通过阻断多通路抑制TGF-β1诱导的肾成纤维细胞分泌细胞外基质[A];第十一届全国中西医结合肾脏病学术会议论文汇编[C];2010年
8 杨汝春;张华琴;朱晓玲;鲁盈;;黄芪对TGF-β1刺激的足细胞骨架蛋白表达异常的干预作用[A];第十一届全国中西医结合肾脏病学术会议论文汇编[C];2010年
9 张继东;冯利;刘春喜;王博;任敏;郭雪峰;;芩丹胶囊对老年自发性高血压大鼠血管外膜重构以及TGF-β1表达的影响[A];第十次中国中西医结合学会心血管病学术大会暨第五次江西省中西医结合学会心血管病学术大会论文汇编[C];2010年
10 赵凯;屠文震;;抗硬化复方对硬皮小鼠皮肤TGF-β_1表达的影响[A];首届中国中西医结合风湿病西北学术会议暨培训班论文汇编[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 广知;多种因素易致“痴”[N];医药经济报;2004年
2 余海若;诺贝尔奖为何13次关注传染病[N];大众科技报;2004年
3 上海香料研究所 朱立弘;化妆品用添加剂初乳精华素有待被认知[N];中国化工报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 林亮;慢病毒介导的Lefty-A RNA干扰对TGF-β诱导HK-2细胞发生EMT转化的影响[D];武汉大学;2010年
2 陈春经;慢病毒载体介导胰岛素样生长因子-1基因修饰肌源性干细胞移植治疗雌性压力性尿失禁大鼠的实验研究[D];福建医科大学;2012年
3 胡晓;雌激素受体α对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的抑制作用[D];重庆医科大学;2011年
4 周建松;HPV16E6/E7共同启动子shRNA慢病毒的构建及其对宫颈癌细胞株抑制作用的体内外研究[D];浙江大学;2012年
5 崔赵丽;气虚、阳虚体质与慢性原发性肾小球疾病中医证候及TGF-β相关性分析[D];北京中医药大学;2011年
6 朱煊;重组慢病毒CXCR7-shRNA对人膀胱癌细胞生物学行为影响的研究[D];中南大学;2012年
7 赖颖晖;慢病毒介导α-反义寡核苷酸对β-地中海贫血小鼠的作用[D];广西医科大学;2010年
8 周海涛;慢病毒介导的Nanog基因对周围神经损伤性神经病理性疼痛模型脊髓突触重塑的影响[D];福建医科大学;2012年
9 刘涛;慢病毒介导的Foxa2和Hnf4a组成性表达对胚胎干细胞向肝细胞分化的影响[D];第三军医大学;2009年
10 田青水;慢病毒介导的RECK基因治疗胰腺癌的实验研究[D];苏州大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 范右飞;成人隐匿性自身免疫性糖尿病患者血清IL-10、TGF-β水平及其与胰岛β细胞功能的关系[D];山东大学;2010年
2 曹硕;TGF-β1、血管紧张素Ⅱ、醛固酮与放射性肺损伤的关系[D];中国医科大学;2010年
3 于小峰;强脉冲光对成纤维细胞分泌TGF-β1的影响及信号通路研究[D];中南大学;2010年
4 孟宪兵;家兔蛛网膜颗粒形态结构及蛛网膜下腔出血后蛛网膜颗粒TGF-β1表达的研究[D];河北医科大学;2011年
5 张思慧;载TGF-β_1微球涂层多孔钛对成骨细胞功能的影响[D];中南大学;2010年
6 袁小洪;重组腺相关病毒介导TGF-β_1基因修饰脂肪干细胞成软骨细胞的研究[D];遵义医学院;2010年
7 卫琴;荷瘤小鼠髓系抑制性细胞比例和TGF-β_1表达水平关系的研究[D];山西医科大学;2010年
8 李强;TGF-β1对大鼠脂肪干细胞体外软骨形成能力影响的研究[D];中南大学;2010年
9 段燕;TGF-β1对IL-1β诱导人牙周膜成纤维细胞分泌HGF影响的研究[D];山西医科大学;2011年
10 黄振杰;TGF-β1诱导肺泡上皮细胞间质转化对肺纤维化的意义研究[D];江苏大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026