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《武汉大学》 2010年
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尾加压素Ⅱ对大鼠骨髓源内皮祖细胞的作用及其分子机制

徐盛开  
【摘要】: 目的:探讨尾加压素Ⅱ(UⅡ)对大鼠骨髓源内皮祖细胞(EPCs)的作用及其分子机制。 方法:选体重110-150g的雄性SD大鼠,分离获取骨髓单核细胞,在内皮细胞培养基中培养诱导,观察细胞生长形态变化,免疫荧光染色鉴定表面标志以及Dil-acLDL摄取试验细胞功能学检测。用RT-PCR、Western Blotting和免疫荧光检测等方法确定GPR14在EPCs上基因和蛋白水平的表达。利用Transwell小室进行趋化实验,观察不同浓度UⅡ对EPCs迁移的影响,检测UⅡ作用EPCs后,RhoA和GTP结合RhoA、MLC磷酸化水平,以及GPR14受体拮抗剂Urantide和Rho激酶抑制剂Y-27632对UⅡ诱导EPCs迁移的影响。CCK-8增殖实验观察不同浓度UⅡ对EPCs增殖的影响,检测UⅡ作用EPCs后,MAPK的激活状态,以及GPR14受体拮抗剂Urantide和MAPK抑制剂对UⅡ诱导EPCs增殖和MAPK磷酸化水平的影响。 结果:从细胞贴壁,伪足样突起,“集落”形成,到条索样结构以及呈典型铺路石样外观,表现内皮祖细胞生长特性。免疫荧光染色鉴定提示CD133、VEGFR-2、vWF表达阳性。摄取DiI-acLDL结合FITC-UEA-1试验,FITC-UEA-1和DiI-acLDL双染色阳性。RT-PCR、Western Blotting和免疫荧光染色等方法检测显示,在分子和蛋白水平EPCs均有GPR14表达,免疫荧光检测GPR14在EPCs膜上染色阳性。UⅡ诱导的EPCs迁移呈典型的剂量依赖型,Urantide和Rho激酶抑制剂Y-27632抑制UⅡ对EPCs的趋化作用(p0.05,vs.UⅡ组)。UⅡ诱导GTP结合RhoA增加,和对照组相比,UⅡ(10-8M)诱导RhoA和GTP结合RhoA增加约3倍(p0.05,UⅡ组vscontrol组),GPR14抑制剂Urantide可以显著抑制这种效应(p0.01 vs.UⅡ组),Rho激酶抑制剂Y-27632抑制作用不明显(p0.05 vs.the 10-8M UⅡgroup)。UⅡ诱导增加MLC磷酸化增加,和对照组相比,UⅡ诱导增加MLC磷酸化增加约2.5倍(p0.05,vscontrol组),GPR14抑制剂Urantide和Rho激酶抑制剂Y-27632均可显著抑制这种效应(p0.05,vs.UⅡ组)。UⅡ对EPCs促增殖作用呈剂量依赖型,Urantide、SB203580和PD98059对UⅡ诱导的促增殖效应有显著抑制作用,抑制程度分别为62.4%、54.3%、和49.2%(all p0.05 vs.the10-8M UⅡ组)。但SAPK/JNK抑制剂SP600125对增殖无抑制作用,且有增强趋势,但无显著差异(p0.05 vs.the 10-8M UⅡ组)。和对照组相比,UⅡ组p38MAPK磷酸化程度显著增高(p0.05 vscontrol组),这种效应可以被GPR14受体拮抗剂Urantide完全阻断(p0.05 vs.UⅡ组),被p38MAPK抑制剂SB203580部分阻断(p0.05 vs.UⅡ组)。和对照组相比,UⅡ组p44/42MAPK磷酸化程度显著增高(p0.05 vscontrol组),这种效应可以被Urantide完全阻断(p0.05 vs.UⅡ组),被p44/42MAPK抑制剂PD98059部分阻断(p0.05 vs.UⅡ组) 结论:1、所培养的细胞证实为内皮祖细胞,EPCs表达UⅡ特异性受体GPR14受体。2、UⅡ是一种新的内皮祖细胞趋化肽,趋化作用呈剂量依赖性,其机制与RhoA/Rho激酶信号通路相关。3、尾加压素Ⅱ促进骨髓源EPCs增殖,其机制与ERK1/2和P38MAPK的活化有关。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R543.5

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