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《武汉大学》 2010年
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萝卜雄性不育系的细胞结构与基因表达特性研究

史胜利  
【摘要】: 萝卜是世界上广泛种植的重要蔬菜作物。自1968年发现Ogura萝卜雄性不育系以来,科研人员在寻找新的不育系品种并对其相应的花粉败育机理研究方面做了大量的工作。一方面,利用萝卜细胞质雄性不育系进行的杂交育种,既可以明显提高萝卜的产量和抗病等抗逆性,又可以通过各种方法把不育基因导入到芸薹属的重要经济植物中,培育出新的雄性不育系品种;另一方面,细胞质雄性不育系是研究细胞质遗传、核质互作和花粉发育的极好材料。目前,对萝卜雄性不育系花药发育中小孢子和绒毡层细胞结构和亚细胞结构变化的研究还较少。对不育系小孢子的败育时间和败育方式的细胞学研究,是对不育系进行分类的重要依据,也是分析其花粉败育机理的重要基础;对比分析可育系和不育系花药发育过程中基因的表达调控,有助于加深对细胞质雄性不育花粉败育机理的认识。 本研究以萝卜可育系805B、DH303B和雄性不育系805A、DH303A为材料,研究了萝卜花药发育过程中绒毡层和花粉细胞结构及亚细胞结构的变化,并对不育系805A的花药发育过程中多糖类物质在花药组织中的代谢和运输进行了观察。本研究还利用cDAN-AFLP技术研究了不育系805A和可育系805B的花药发育过程中基因转录表达的差异,克隆了在花药发育过程中差异表达的基因,并对其进行了序列相似性比较分析,推测其功能及其在花粉败育中可能发挥的作用。 主要研究结果如下: 在萝卜雄性不育系805A的花药发育过程中,花药中4个药室的败育分为两类:第1类药室只有1个,其败育发生在花粉母细胞时期,到减数分裂前,整个药室完全败育。花药败育时绒毡层和小孢子的结构变化特征为:花粉母细胞早期,出现细胞质收缩和质壁分离现象,绒毡层细胞内出现较大的液泡;在花粉母细胞晚期或减数分裂前,花粉细胞内含物基本消失,绒毡层细胞内部的结构完全解体;单核小孢子早期,绒毡层完全消失,药室内只剩余少部分团状物聚集在药室的中央部位,其中包含有细胞质收缩小孢子。随后,此药室内的小孢子完全消失。第2类药室有3个,其绒毡层的异常始于花粉母细胞时期,到单核花粉末期或双核花粉早期绒毡层完全解体,而花粉败育始于四分体晚期,到保持系的双核花粉时期,花粉完全消失。此时,整个花药只剩下没有开裂的4个空药室。花药败育时的结构变化特征为:花粉母细胞时期,花粉母细胞发育正常,绒毡层细胞中出现较大的液泡;四分体和单核居中期,小孢子细胞中出现较大的液泡,同时一部分小孢子内含物完全消失,绒毡层异常肥大;液泡化小孢子时期和双核花粉早期,绒毡层完全解体,小孢子内含物完全消失,花粉完全败育。不育系805A花药发育过程中糖类的代谢及运输特征为:花粉母细胞时期,糖类在药室壁和维管束周围的薄壁组织中大量积累,形成很多的淀粉粒;单核居中期,在保持系花药中,这些淀粉粒逐渐减少,但在不育系中,这些淀粉粒仍然大量存在;液泡化小孢子时期,保持系中的淀粉粒完全消失,但不育系中仍存在少量淀粉粒,此时药室壁的内层细胞染色很深。 在不育系DH303A花药发育的四分体时期,一些小孢子出现了质壁分离现象,且所有小孢子聚集在药室中央。此时,绒毡层厚薄均匀,结构正常。单核居中期,一部分小孢子的细胞质就已经解体,细胞内含物消失,此时绒毡层厚薄均匀,细胞结构正常,细胞质浓稠。液泡化小孢子时期,越来越多的小孢子的细胞质解体,花粉被严重膨大、液泡化的绒毡层挤压在药室中央、随后绒毡层解体,小孢子败育。最终,花药的4个药室壁没有开裂,内部结构全部消失。 分别以保持系和不育系花药发育过程中三个阶段的cDNA作为模板,利用128对E+2/M+3引物进行选择性扩增,对可育系805B和不育系805A在花药发育中的基因差异表达进行研究,总共发现了2556个TDF (transcript-derived fragment),发现在可育系和不育系花药发育的三个阶段中基因表达有明显差异,这说明不育系基因表达在花药发育早期就已经出现明显的异常,暗示不育突变干扰了与花药发育早期相关的基因的表达调控。 在所有的TDF中,检测到11种重要的差异表达类型。这些基因差异表达反映了保持系和不育系在花药发育过程中基因的异常表达,说明许多重要基因表达发生改变造成相关的生理功能紊乱,导致不育系花药发育异常和花粉败育。 我们克隆测序分析了223差异表达的cDNA片段。基于同源序列的候选基因法,通过检索GenBank和TAIR数据库获得与216个TDF相关的基因信息。分析结果后,发现35个TDF的功能与转录有关,占总测序TDF的16.2%;22个TDF的功能与细胞内的信号传导有关,占总测序TDF的10.2%;占6.9%,15个TDF的功能与DNA合成、细胞生长和分裂有关;另有15个TDF、占6.9%的TDF与细胞的新陈代谢有关;13个,占6%的TDF与细胞的生物合成有关。此外,发现23个未进行功能分类的TDF,占总测序TDF的10.6%;41个无法未知功能的TDF,占总测序TDF的18.9%;与转录和信号传导相关的基因的异常表达暗示了花药的发育和分化受到影响,部分解释了不育系805A花粉败育特征。 本研究分析了一些花药发育过程中差异表达的基因,并讨论了这些基因在花药败育中可能发挥的作用。
【学位授予单位】:武汉大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S631.1

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