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《华中科技大学》 2010年
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小麦抗冻蛋白基因的分离与遗传转化研究

高轩  
【摘要】:小麦起源于中东的新月沃土地区,是世界各地广泛种植的禾谷类作物,也是世界上总产量位居第二的粮食作物。自1992年第一株转基因小麦在美国问世至今,国内外应用转基因技术对小麦进行大量研究,在抗虫、抗旱、品质改良等方面取得了很多成绩。利用转基因技术向小麦中导入抗性和品质的关键基因,可以加快小麦品种的选育过程。低温冻害是农业生产中一种严重的自然灾害,也是某些农作物区域性和季节性限定因素。植物抗冻相关基因的分离、表达调控和功能分析对于阐明植物抗低温的分子机理的理论研究以及利用转基因技术增强小麦等作物的抗寒能力的育种实践均具有重要的意义。 本论文包含两部分研究内容:一部分是小麦抗冻蛋白相关基因的分离与功能研究;另一部分是作为一种新的小麦转基因报告基因AtMYB12在小麦中的功能验证,以期为以后将抗冻蛋白转入小麦中作准备。同时我们还探讨了AtMYB12在小麦中调节黄酮醇代谢的作用。 通过cDNA-AFLP技术,我们在小麦中获得了一条在低温下差异表达的cDNA片段,测序结果表明,该cDNA片段编码的部分蛋白质序列与极区鱼抗冻蛋白typeⅢantifreeze protein的同源性高达94%。利用RACE技术扩增出该基因的全长cDNA,为782bp,开放阅读框为504 bp,编码一个含有168个氨基酸残基的蛋白质,推测其分子量为18.19 kD, pI值为8.8。通过生物信息学的方法对该基因分析结果显示,其所编码得蛋白与已报道的植物抗冻蛋白完全不同,我们将该基因命名为TaAFPⅢ这是第一个从植物中获得的与鱼类抗冻蛋白高度相关的蛋白质,这一发现为研究植物抗冻的分子机理提供了新的切入点。 利用实时荧光定量RT-PCR技术分析了TaAFPⅢ对低温、渗透胁迫和逆境胁迫相关激素处理下的表达差异。结果表明,叶片中TaAFPⅢ的表达显著高于根,在低温处理第二天,叶片中TaAFPⅢ表达量提高了266倍。用0.2 mM的茉莉酸甲酯和15%的PEG10000处理小麦6h后,TaAFPⅢ表达量有所提高,但随着时间的延长,TaAFPⅢ表达量又趋于正常。0.2 mM的水杨酸处理对TaAFPⅢ表达量没有明显影响,而0.1 mM的ABA处理对TaAFPⅢ的表达有一定程度的抑制作用。 为研究TaAFPⅢ的生物学功能,我们首先构建了TaAFPⅢ的原核表达载体pET32a-TaAFPⅢ,并成功实现了其在大肠杆菌中的表达,为今后研究AFP蛋白的理化性质奠定了基础。将TaAFPⅢ置于CaMV 35S启动子下游构建的双元转化载体pBI121-TaAFPⅢ,通过农杆菌侵染方法成功地转化了烟草。抗冻实验结果表明,转基因烟草的抗冻能力得到了显著提高,-20℃的低温环境处理4h后再转移至常温下的转基因烟草能100%的恢复生长,而对照植株则全部死亡。这一结果表明,TaAFPIII在植物抗低温反应中发挥着重要的作用。 AtMYB12属拟南芥R2R3-MYB转录因子,是黄酮类代谢产物生物合成途径的专一性激活因子。为探讨AtMYB12调节植物黄酮代谢和作为转基因植物报告基因的可能性,我们分别将AtMYB12克隆到pLRPT和pBI121质粒中,构建了pLRPT-MGH和pBI121-MYB12融合基因表达载体,以模式小麦品系中国春材料进行了基因枪轰击。通过瞬时表达发现,小麦受体材料的花苷色素在短时间内就有大量累积,它与GFP、GUS作为报告基因相比,具有明显的优势,因此,AtMYB12完全可以可以作为一种新型的报道基因,也可以作为调节植物体内黄酮醇代谢的基因资源加以一用。 本文的研究结果对已阐明植物抗低温的分子机理的理论研究以及利用转基因技术增强作物的抗寒能力的育种实践具有重要的参考价值。
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