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《华中科技大学》 2010年
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硒蛋白S和硒蛋白K在内质网应激中的调节作用

杜少卿  
【摘要】:内质网(ER)是哺乳动物细胞中一个极为重要的细胞器,既是蛋白质合成和翻译后修饰、折叠与装配的重要场所,也是细胞第二信使Ca2+的贮存器,还与糖类、脂类和甾体类激素的合成、血糖浓度的调节、解毒、转运、同化等有关。大量研究显示内质网应激与许多疾病有关,如脑局部缺血损伤、神经退行性疾病、糖尿病等。该领域已成为当前生命科学研究的热点之一 硒是哺乳动物中的一种必需微量元素,主要以硒蛋白的形式存在于生物体中,在许多生理过程中发挥着十分重要的作用。在25种哺乳动物硒蛋白中有7种定位于内质网上,它们包括15-kDa硒蛋白、Ⅱ型脱碘酶、硒蛋白K、硒蛋白M、硒蛋白N、硒蛋白S和硒蛋白T。除了Ⅱ型脱碘酶外其余硒蛋白的功能未知或知之甚少。因此,开展内质网硒蛋白的研究对于深入了解硒的生物学功能具有重要的科学意义和潜在的应用价值。 本文以HepG2细胞为对象,研究了SelS、SelK在内质网应激中的作用,重点探讨了SelS和SelK基因沉默对内质网应激试剂诱导细胞内质网应激和细胞凋亡的影响,主要结果如下: (1)补硒和SelS基因沉默对β-巯基乙醇诱导内质网应激的影响 采用MTT检测、荧光定量PCR技术、免疫印迹、Hoechst33342染色和流式细胞仪研究了补硒和SelS基因沉默对β-巯基乙醇诱导内质网应激的影响。结果表明,100 nM Na2SeO3或10mMβ-ME单独作用可分别显著增加HepG2细胞中SelS蛋白的表达量至130%和161%;100nM Na2SeO3还可显著降低p-ME诱导的细胞死亡和凋亡。提示补硒可能通过增加SelS等硒蛋白的表达抑制β-ME诱导的内质网应激对细胞的损伤。进一步通过基因沉默技术分别抑制SelS mRNA和蛋白质表达至23%和46%后,可分别使10mMβ-ME和10μg/mL Tm作用HepG2细胞时细胞的存活率与对照组相比显著下降10%和14%;10mMβ-ME作用SelS基因沉默组细胞24小时后,GRP78蛋白水平与β-ME作用于正常细胞相比显著增加,说明SelS在抵抗β-ME诱导的内质网应激方面发挥重要作用。且当10mMβ-ME作用正常细胞后,通过细胞核染色可以观察到少量细胞的细胞核固缩,出现早期凋亡现象;而当10:mMβ-ME作用于SelS沉默组细胞后可以观察到大部分细胞核固缩,部分细胞核碎裂成小块,呈现典型的凋亡形态,细胞凋亡现象较10mMβ-ME作用正常细胞有显著的增加,通过流式细胞仪检测其凋亡率也显著升高,可见细胞中SelS的沉默可使细胞对β-ME引起的凋亡更加敏感。通过透射电子显微镜观察到SelS的沉默得到同样的结果,这进一步表明SelS对于保护HepG2细胞抵抗内质网应激诱导的凋亡具有重要作用。 (2) SelS基因沉默对内质网上其它硒蛋白表达的影响 通过基因沉默和荧光定量PCR技术检测了SelS、SelK或内质网上非硒蛋白Derlin-1沉默对内质网其它硒蛋白表达的影响。结果表明,SelS基因沉默的时候内质网上的硒蛋白SelK、SelT、SelN和Sep15 mRNA表达也被抑制,而非硒蛋白Derlin-1的表达不受SelS基因沉默的影响;而SelK或Derlin-1沉默则对内质网上的其它硒蛋白的表达没有影响。通过BLAST检索了SelS siRNA序列的特异性,结果表明SelS siRNA序列与内质网上其它硒蛋白没有同源性。在此基础上,研究了SelS与SelK在内质网应激条件下的相互影响,结果表明当细胞中SelS表达沉默后,10μg/mL Tm作用下SelK mRNA表达与正常组相比显著增加;与之相反,当细胞中SelK表达沉默时,10μg/mL Tm作用下SelS mRNA表达与正常组相比显著增加。说明SelS基因沉默可导致内质网上的其它硒蛋白表达的下降,并且SelS与SelK生物功能之间可能有互补作用。 (3) SelK在内质网应激中的调节作用 基于SelK和SelS在蛋白质一级结构上的类似性及SelS与SelK在内质网应激条件下可能的互补作用,通过MTT检测,SelK小分子RNA干扰,荧光定量PCR技术、免疫印迹、Hoechst 33342染色及Annexin-V-FITC/PI双染检测等方法研究了内质网应激试剂p-ME和Tm对SelK表达的影响和SelK对于内质网应激导致的HepG2细胞损伤的保护作用。结果表明,10mMβ-ME和10μg/mL Tm可分别显著增加HepG2细胞中SelK mRNA和蛋白质表达至200%、240%和250%、240%。RNA干扰抑制SelK mRNA和蛋白质表达可明显促进内质网应激诱导的HepG2细胞凋亡,且在内质网应激试剂的作用下,SelK沉默组与正常组相比促凋亡基因GADD153蛋白表达和caspase-3酶的活性均显著升高。这些结果第一次揭示了SelK是一个内质网应激调节蛋白,并且在保护细胞抵抗内质网应激诱导的细胞凋亡方面发挥重要作用。
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