脂氧素对子宫内膜异位症抑制作用的研究
【摘要】：目的：
1.研究子宫内膜异位症发展过程中异位病灶的形态学变化特点、腹腔巨噬细胞吞噬功能改变情况以及相关促炎细胞因子、基质金属蛋白酶的表达和活力变化特征。
2.体外研究白介素-1β和外源性脂氧素(15-epi-LXA4)对人异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞炎性介质表达水平的影响。
3.体内研究外源性脂氧素(15-epi-LXA4)干预子宫内膜异位症BALB/c小鼠后异位病灶生长情况及其对小鼠腹腔免疫细胞中促炎细胞因子和基质金属蛋白酶表达的作用。
方法：
1.构建子宫内膜异位症BALB/c小鼠模型,在建模后第1,2,3,4,5,6,9,12,15,18,21天分别观察子宫内膜异位症小鼠模型异位病灶的形态变化。采用荧光微球吞噬实验和流式细胞术检测子宫内膜异位症小鼠腹腔中巨噬细胞的吞噬功能。应用实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附试验分别检测子宫内膜异位症小鼠腹腔中促炎细胞因子的基因和蛋白质水平；使用明胶图谱法检测子宫内膜异位症小鼠腹腔液中基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的酶活性。
2.运用细胞原代培养方法,分离纯化获取人异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,并利用免疫细胞化学法对细胞类型进行鉴定。采用不同浓度(0,0.1,1,5,10 ng/ml)白介素-1β处理人异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞；不同浓度(0,0.1,1,10,100nM)的15-epi-LXA4预处理细胞30min,然后再加入1 ng/ml白介素-1β继续处理细胞。作用结束后,应用实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附试验分别检测培养细胞和上清液中炎性因子的基因和蛋白表达水平。
3.外源性脂氧素(15-epi-LXA4)注射入子宫内膜异位症小鼠腹腔中(剂量为5μg/kg),观测15-epi-LXA4对小鼠异位病灶的抑制作用。同时,利用实时荧光定量PCR检测子宫内膜异位症小鼠腹腔免疫细胞、在位子宫内膜、异位子宫内膜中促炎细胞因子的基因水平；酶联免疫吸附试验检测小鼠腹腔液中炎性介质的蛋白浓度；明胶酶谱法检测小鼠腹腔液中基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的酶活性。
结果：
1.建模后不同时间内,BALB/c小鼠异位病灶的形态、腹腔巨噬细胞吞噬功能和炎性介质的表达水平均呈现出一定的变化特征。
2.在造模后的11个观察日里,子宫内膜异位症小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力、腹腔炎性介质(包括白介素-1β、肿瘤坏死因子-α、血管内皮生长因子、单核细胞趋化蛋白-1、基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9)的表达水平以及基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的酶活性均显著高于假造模组小鼠。
3.白介素-1β可刺激人异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞白介素-6、白介素-8、单核细胞趋化蛋白-1、肿瘤坏死因子-α、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的基因和蛋白表达。
4.15-epi-LXA4显著抑制白介素-1β诱导的人异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞白介素-6、白介素-8、单核细胞趋化蛋白-1、肿瘤坏死因子-α、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的基因和蛋白表达。
5.15-epi-LXA4显著抑制子宫内膜异位症小鼠异位病灶的重量和大小,并且不影响小鼠的性周期,也无明显副作用。但是15-epi-LXA4只能抑制子宫内膜异位症小鼠异位病灶的生长,不能阻止子宫内膜异位症的发生。
6.15-epi-LXA4显著降低子宫内膜异位症小鼠腹腔免疫细胞中白介素-1β、肿瘤坏死因子-α、基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的基因和蛋白表达；同时显著抑制子宫内膜异位症小鼠在位和异位子宫内膜组织中基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的基因水平。
7.15-epi-LXA4显著抑制子宫内膜异位症小鼠腹腔液中基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的酶活性。
结论：
1.子宫内膜碎片进入小鼠腹腔后可引起腹腔炎症环境的改变,导致巨噬细胞吞噬作用的增强和各种炎性介质表达水平的上升,并且在子宫内膜异位症的发病过程中呈现出一定的变化规律。这种变化规律可能与子宫内膜异位症的发生发展有关。
2.15-epi-LXA4显著抑制白介素-1β引起的人异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞炎性介质的表达,表现出良好的抗炎促炎症消退效应。
3.15-epi-LXA4抑制子宫内膜异位症小鼠异位病灶的生长,这种抑制效应可能是通过降低相关炎性介质的表达和活性来实现的,炎症自主消退策略可能成为治疗子宫内膜异位症的新途径。
【关键词】：脂氧素 子宫内膜异位症 炎症反应 炎性介质 基因和蛋白表达 【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R711.71
【目录】：
- 英文缩略词表6-8
- 中文摘要8-11
- ABSTRACT11-14
- 前言14-22
- 第一部分 子宫内膜异位症小鼠异位病灶特点及其微环境中炎性介质和相关蛋白酶的变化规律研究22-53
- 材料与方法23-30
- 一、主要试剂和仪器23-24
- 二、动物分组及内异症小鼠模型的建立24-26
- 三、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验26-27
- 四、内异症小鼠腹腔液中炎性因子基因和蛋白水平的检测27-29
- 五、明胶酶谱法检测内异症小鼠腹腔液MMP-2和MMP-9的酶活性29
- 六、统计学分析29-30
- 结果30-43
- 一、EM小鼠模型建立情况30-35
- 二、EM小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的变化规律35-37
- 三、EM小鼠腹腔促炎细胞因子和基质金属蛋白酶的变化规律37-43
- 讨论43-49
- 一、BALB/c小鼠EM模型的建立及其形态学的变化43-45
- 二、EM小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的变化规律45-46
- 三、EM小鼠促炎细胞因子和基质金属蛋白酶水平的变化规律46-49
- 参考文献49-53
- 第二部分 脂氧素对人异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的抗炎效应研究53-79
- 材料与方法54-61
- 一、主要试剂和仪器54-56
- 二、实验方法56-60
- 三、统计学分析60-61
- 结果61-71
- 一、人异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的原代培养61-62
- 二、IL-1β对人异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞中炎性介质的影响62-65
- 三、外源性脂氧素(15-epi-LXA_4)对人异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分泌炎性介质的影响65-71
- 讨论71-75
- 一、异位子宫内膜细胞的原代培养71-72
- 二、炎性刺激对异位子宫内膜细胞的影响72-73
- 三、脂氧素对异位子宫内膜细胞的抗炎效应73-75
- 参考文献75-79
- 第三部分 脂氧素抑制小鼠子宫内膜异位症发展的作用机制研究79-98
- 材料与方法80-85
- 一、主要试剂和仪器80-81
- 二、实验动物81
- 三、实验方法81-84
- 四、统计学分析84-85
- 结果85-92
- 一、15-epi-LXA4抑制EM小鼠异位病灶的大小85-86
- 二、15-epi-LXA4不影响EM小鼠性周期也无明显副作用86
- 三、15-epi-LXA4不能阻止子宫内膜异位症的发生86-87
- 四、15-epi-LXA4降低EM小鼠IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白水平87-88
- 五、15-epi-LXA4抑制EM小鼠MMP-2和MMP-9的表达88-90
- 六、15-epi-LXA4抑制EM小鼠MMP-2和MMP-9的酶活性90-92
- 讨论92-94
- 参考文献94-98
- 结论98-99
- 综述99-110
- 参考文献105-110
- 附录110-111
- 致谢111-112
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