收藏本站
《华中科技大学》 2011年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24靶向治疗肝癌的体内外实验研究

肖朝文  
【摘要】:第一部分携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24载体的构建及表达鉴定 目的:本文通过构建携带人MDA-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24载体,观察其在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达,探讨其对肝癌基因治疗的理论价值。 方法:酶切质粒ZD55-IL24得到IL24连接到pClon9-INS-IL24,将pClon9-INS-IL24共酶切得到INS+IL24片段,装入SG502-△CR2载体中,获得重组质粒pSG600-IL24,以Polyfect介导将其与腺病毒骨架质粒ppE3共转染293细胞,通过细胞内同源重组,生成携带人MDA-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24,同样的方法构建空载体SG600-EGFP。将其感染人肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMMC7721和正常的肝细胞L02, RT-PCR验证mda-7/IL-24基因的表达。 结果:可见感染后的HEK293细胞出现特征性CPE,细胞变大、变圆、漂浮,呈葡萄串聚集。取克隆1和克隆2的病毒DNA各2μ1为模板,通过PCR方法扩增出约640bp的特异性片段,其大小与阳性对照相符,而阴性对照SG600-EGFP则无片段扩增。RT-PCR结果提示该载体能介导外源基因mda-7/IL-24在人肝癌细胞和正常肝细胞中高效表达。 结论:成功构建了携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24载体,该载体能介导mda-7/IL-24基因在人肝癌细胞和正常肝细胞中高效表达。 目的:观察携带人:mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24对肝癌细胞株HepG2. Hep3B、SMMC7721、MHCC97L、HCCLM3和正常的肝细胞L02的选择性抗肿瘤作用,为肝癌的基因治疗提供理论基础。 方法:将携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24感染肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMMC7721、MHCC97L、HCCLM3和正常的肝细胞L02。通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western-blot观察MDA-7/IL-24基因的表达,四甲基偶氮哩蓝染色法(MTT)观察肝癌细胞的生长抑制,Hoechst33258染色观察其对肝癌细胞的抗肿瘤作用,Annexin-V和PI双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡,以及利用PI单染法流式细胞仪检测SG600-IL24对细胞周期的影响。 结果:RT-PCR及Western-blot提示溶瘤腺病毒SG600-IL24能介导外源基因MDA-7/IL-24在肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMMC7721、MHCC97L、HCCLM3和正常的肝细胞L02中高效表达,ELISA检测结果提示细胞培养上清液中MDA-7/IL-24蛋白也明显增加,MTT结果表明SG600-IL24能明显抑制各种肝癌细胞的生长,Hoechst33258染色提示SG600-IL24促进肝癌细胞的凋亡,流式细胞仪提示SG600-IL24能选择性杀伤肝癌细胞,细胞周期分析提示MDA-7/IL-24阻滞肝癌细胞在G2/M期,而对正常的肝细胞没有明显的促凋亡作用和增殖阻滞作用。 结论:携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24能特异性杀伤不同转移潜能的肝癌细胞和诱导凋亡,促进肝癌细胞增殖阻滞,而对正常肝细胞无明显的促进凋亡和增殖阻滞作用。 第三部分溶瘤腺病毒SG600-IL24选择性杀伤肝癌细胞的机理探讨 目的:探讨携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24对肝癌细胞株HepG2、HCCLM3的杀伤机制,为肝癌的基因治疗提供理论基础。 方法:用溶瘤腺病毒SG600-IL24干预肝癌细胞株HepG2、HCCLM3和正常肝细胞株LO2。通过RT-PCR和Western-blot蛋白印迹检测SG600-IL24干预后,肝癌细胞株HepG2、HCCLM3和正常肝细胞株LO2内不同时间点总STAT3以及信号通路下游信号分子C-myc、bax. bcl-2、bcl-xl、CyclinD2、Survivin、XIAP、OPN、MMP-2、MMP-9和VEGF基因和蛋白的表达变化,同时检测各细胞株在溶瘤腺病毒SG600-IL24处理后,磷酸化STAT3蛋白的表达变化。 结果:RT-PCR和Western-blot结果提示STAT3以及信号通路下游信号分子C-myc、Bcl-xl、bcl-2、CyclinD2、Survivin、MMP-2、MMP-9、XIAP、OPN、VEGF基因和蛋白表达水平下调,而Bax基因和蛋白表达水平在溶瘤腺病毒SG600-IL24感染后上调。而磷酸化STAT3蛋白在感染后先上升后下降,在感染2小时达到峰值。 .结论:溶瘤腺病毒SG600-IL24可能通过抑制STAT3及下游的信号通路来达到抗肝癌的作用,而正常肝细胞几乎不受此影响,使得溶瘤腺病毒SG600-IL24具有显著的选择性抗肿瘤效应。 第四部分溶瘤腺病毒SG600-IL24和干扰素联合治疗裸鼠肝癌的研究 目的:利用携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24与干扰素(Interferon, IFN)联合治疗肝癌裸鼠移植瘤,探讨病毒基因治疗和新辅助治疗相结合治疗肝癌的新方法。 方法:首先建立裸鼠皮下种植肝癌模型,当肿瘤体积生长至100-150mm3,计为第0天,并将裸鼠随机分为4组,每组8只:(1)对照组:正常荷瘤裸鼠,每只裸鼠给予生理盐水0.3ml,右侧腹腔内注射,每天一次,共3次。(2)新辅助治疗组(IFN组):IFN1.5×104IU/g/只,注射于右侧腹腔,每天一次,共10次。(3)基因治疗组(SG600-IL24组):给予溶瘤腺病毒(SG600-IL24)治疗,肿瘤局部多点注射,每只2×108PFU/次,共5次,隔日一次。(4)基因治疗+新辅助治疗组(SG600-IL24+IFN组):IFN的用法同前,SG600-IL24在IFN治疗结束后一天进行,SG600-IL24的用法同基因治疗组。并在干预30d后检测肿瘤组织中mda-7/IL-24基因和蛋白的表达,随后观察各组裸鼠生存时间及肿瘤体积的变化。 结果:溶瘤腺病毒SG600-IL24介导的外源基因MDA-7/IL-24在基因治疗组和联合治疗组裸鼠体内表达明显增高,SG600-IL24+IFN联合治疗组裸鼠有3只生存时间超过120d,达到长期生存,与其他三组比较生存期明显延长(P0.01); SG600-IL24+IFN组裸鼠肝癌体积也明显小于SG600-IL24组或IFN(P0.01)。 结论:溶瘤腺病毒SG600-IL24联合干扰素对裸鼠人肝癌种植模型有很好的协同抗肿瘤作用,为肝癌的基因病毒治疗提供了很好的前景。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R735.7

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 ;Oncolytic adenovirus-mediated MDA-7/IL-24 overexpression enhances antitumor activity in hepatocellular carcinoma cell lines[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2010年06期
2 魏启幼,吴元清,范松青,周金平;MMP-2,MMP-9,TIMP-1和TIMP-2在肝癌中原位表达[J];湖南医科大学学报;2003年03期
3 ;An armed oncolytic adenovirus system, ZD55-gene, demonstrating potent antitumoral efficacy[J];Cell Research;2003年06期
4 ;Targeting gene-virotherapy of cancer[J];Cell Research;2006年08期
5 ;Antitumor activity of an hTERT promoter-regulated tumor-selective oncolytic adenovirus in human hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2006年47期
6 ;Oncolytic adenovirus SG600-IL24 selectively kills hepatocellular carcinoma cell lines[J];World Journal of Gastroenterology;2010年37期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王琪琳;桑青;曲爱琴;;多糖凝集素的细胞免疫和抗肿瘤研究进展[J];安徽农业科学;2009年05期
2 王宏芳;李金华;刘扬;李艳博;王志成;刘威武;龚守良;;单重靶向条件复制型腺病毒穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K的构建及鉴定[J];吉林大学学报(医学版);2010年05期
3 卢根林;邓勇;樊海宁;秦伟;曹越;张永健;格日力;任利;;缺氧应激对人肝癌细胞黏附、侵袭和迁移能力的影响[J];第三军医大学学报;2008年08期
4 张火俊;陆建平;杨继金;朱俊;李欲晓;郝强;生晶;张顺民;;经动脉灌注端粒酶抑制剂AZT对大鼠Walker-256肝肿瘤的影响[J];放射学实践;2012年01期
5 彭林辉;周杰;霍枫;詹世林;张琪;苏长青;钱其军;;基因病毒治疗系统CNHK300-mIFN-γ治疗肝癌的实验研究[J];广东医学;2011年22期
6 肖永胜;周俭;樊嘉;;肝细胞癌根治性切除术后复发转移的预防[J];肝胆胰外科杂志;2010年06期
7 Wan-Yee Lau;Eric C. H. Lai;;Hepatocellular carcinoma: current management and recent advances[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2008年03期
8 Wan-Yee Lau;Eric C.H.Lai;Stephanie H.Y.Lau;;The current role of neoadjuvant/adjuvant/chemoprevention therapy in partial hepatectomy for hepatocellular carcinoma:a systematic review[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2009年02期
9 ;Oncolytic adenovirus-mediated MDA-7/IL-24 overexpression enhances antitumor activity in hepatocellular carcinoma cell lines[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2010年06期
10 江家骥;董菁;叶胜龙;;HBV/HCV相关性肝细胞癌抗病毒治疗专家建议[J];传染病信息;2013年02期
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王晖;AF-2364的精子制动作用及机制研究[D];南京医科大学;2009年
2 周玮;溶瘤病毒介导的TRAIL基因治疗恶性肿瘤的研究[D];浙江大学;2011年
3 熊杰;新型嵌合启动子在肿瘤治疗中的应用[D];武汉大学;2010年
4 黄海燕;表达Apoptin基因重组腺病毒对肝癌细胞BEL-7402及转移模型的抑制作用[D];吉林大学;2011年
5 刘妍;双特异性抗肿瘤重组腺病毒对肝癌细胞及其模型动物的治疗作用研究[D];吉林大学;2011年
6 祝贺;IL-24基因靶向杀伤卵巢癌细胞及其影响化疗药物敏感性的体外实验研究[D];吉林大学;2011年
7 黄庆;抑癌基因SARI在慢性髓细胞白血病中异常调控分子机制及作用的研究[D];华中科技大学;2011年
8 黄宏兴;去卵巢大鼠肌骨线粒体活性变化及骨康方干预的实验研究[D];湖南中医药大学;2011年
9 杨闯;抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体对结直肠癌靶向治疗的研究[D];重庆医科大学;2011年
10 曾文胜;CS-PEG纳米载体介导Mcl-1 siRNA联合奥沙利铂治疗肝癌的实验研究[D];中南大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 肖连立;携带IL-24基因的E1区双调控溶瘤腺病毒治疗肿瘤的研究[D];浙江理工大学;2010年
2 谭渊;利用IETD连接TRAIL和Smac的靶向性双基因溶瘤腺病毒治疗癌症的研究[D];浙江理工大学;2010年
3 钱静;携带Apoptin双调控溶瘤腺病毒治疗肝癌的研究[D];浙江理工大学;2010年
4 牛娜;携带掌叶半夏凝集素基因的溶瘤腺病毒研究[D];浙江理工大学;2010年
5 李新;通过急性髓性白血病干细胞表面CD123导入溶瘤腺病毒的研究[D];浙江理工大学;2010年
6 张静;删除E1B的靶向溶瘤腺病毒携带IL-24基因治疗肝癌的研究[D];浙江理工大学;2010年
7 吕赛群;基于microRNA调控靶向肿瘤细胞的溶瘤腺病毒的研究[D];浙江理工大学;2010年
8 赵金艳;代谢异常及N-糖基化在原发性肝细胞癌中的研究[D];第二军医大学;2011年
9 金晶;诺迪康对AD模型大鼠学习记忆及海马AchE、ChAT活性的影响[D];重庆医科大学;2011年
10 欧阳小波;Hedgehog信号通路对胃癌细胞外基质降解作用的探讨[D];重庆医科大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 王从俊;薛新波;易继林;吴在德;陈堃;郑建伟;吉文伟;于愿;;Replication-incompetent Adenovirus Vector-mediated MDA-7/IL-24 Selectively Induces Growth Suppression and Apoptosis of Hepatoma Cell Line SMMC-7721[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2008年01期
2 ;An armed oncolytic adenovirus system, ZD55-gene, demonstrating potent antitumoral efficacy[J];Cell Research;2003年06期
3 ;Targeting gene-virotherapy of cancer[J];Cell Research;2006年08期
4 ;Melanoma differentiation-associated gene-7, MDA-7/IL-24, selectively induces growth suppression, apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 by replication-incompetent adenovirus vector[J];World Journal of Gastroenterology;2006年11期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈泽建,徐丁尧,陆应麟,杜芝燕,徐元基,张金强,陈惠华,凌贤龙,吕品;靶向性溶瘤腺病毒对肝癌细胞的特异性杀伤研究[J];中华肿瘤杂志;2004年09期
2 陈泽建,杜芝燕,徐元基,张金强,陈惠华,陆应麟;杂合启动子HREAF的构建及其肝癌特异性分析[J];生物技术通讯;2003年06期
3 徐伟;郝林;韩从辉;杨建军;;溶瘤腺病毒在肿瘤治疗中的作用[J];徐州医学院学报;2010年03期
4 马越;张凤春;;溶瘤腺病毒对肿瘤干细胞的靶向治疗[J];中国肿瘤;2009年11期
5 杨春华;刘彦群;魏志平;毛立军;裴东生;史震;郑骏年;;溶瘤腺病毒介导的IL-18在黑素瘤A375细胞中的表达[J];中国皮肤性病学杂志;2008年09期
6 刘旭;张东亮;刘文虎;;溶瘤腺病毒在肿瘤靶向治疗中的研究进展[J];现代生物医学进展;2011年07期
7 陈猛;郝林;韩从辉;;溶瘤腺病毒治疗膀胱癌进展[J];医学综述;2011年16期
8 陈建发;溶瘤腺病毒的研究进展[J];肿瘤防治研究;2004年04期
9 何向东;王志平;;构建溶瘤腺病毒的策略[J];微生物学免疫学进展;2007年01期
10 马蕾娜;刘佳;钱其军;;携带5/35嵌合型fiber的溶瘤腺病毒对胃癌细胞的杀伤能力研究[J];浙江理工大学学报;2008年05期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 王莹;王云贵;金洁;钱其军;钱文斌;;嵌合型溶瘤腺病毒对造血干细胞体外净化作用的研究[A];2009年浙江省中医药学会血液病学术年会、浙江省中西医结合学会血液病学术年会暨国家级中西医结合血液病新进展继续教育学习班论文汇编[C];2009年
2 浦颖艳;方琳;沈权;孙丽君;胡小翠;王艳;曹祥荣;苏长青;;肿瘤特异性溶瘤腺病毒载体的构建及表达的初步研究[A];江苏省遗传学会第七届二次代表大会暨学术研讨会论文摘要汇编[C];2008年
3 董成亚;杨宾霞;王楠;林永敏;任倩;马小彤;;mda-7/IL-24通过ROS产生诱导急性髓系白血病细胞向单核系分化[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 肖朝文;携带人mda-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24靶向治疗肝癌的体内外实验研究[D];华中科技大学;2011年
2 王芳;膀胱组织特异性溶瘤腺病毒在动物体内的生物分布及安全性评价[D];兰州大学;2013年
3 陈泽建;肝癌靶向性溶瘤腺病毒的构建及其对肝癌细胞的特异性杀伤研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年
4 陈漪;携带IL-24基因的溶瘤腺病毒抑制原发性肝癌肺转移的作用研究[D];复旦大学;2009年
5 孙其喆;溶瘤腺病毒介导的RNA干扰抑制肝癌细胞生长的实验研究[D];南方医科大学;2012年
6 刘新建;携带mda-7/IL24的嵌合型溶瘤腺病毒对wnt信号异常肿瘤的靶向基因—病毒治疗[D];上海交通大学;2011年
7 郑建伟;腺病毒携带的MDA-7/IL-24基因对肝癌细胞生物学作用机制的研究[D];华中科技大学;2010年
8 胡泽斌;溶瘤腺病毒载体系统的构建及其功能研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
9 黄耀;基于miR-199调控靶向肝癌细胞的溶瘤腺病毒系统研究[D];第二军医大学;2012年
10 黄晓园;新型溶瘤腺病毒M1体内应用的效应和安全性研究及靶向性输送的探索[D];华中科技大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 祁媚姣;超氧阴离子对膀胱癌组织特异性溶瘤腺病毒基因治疗的作用[D];兰州大学;2013年
2 杨耿兵;新型溶瘤腺病毒靶向治疗恶性肿瘤的研究[D];浙江理工大学;2011年
3 于丽;穿膜肽11R在携带P53基因的溶瘤腺病毒中抗肿瘤作用的研究[D];浙江理工大学;2011年
4 冯志华;携带11R穿膜肽-P53融合蛋白基因的溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用研究[D];浙江理工大学;2010年
5 牛娜;携带掌叶半夏凝集素基因的溶瘤腺病毒研究[D];浙江理工大学;2010年
6 钱静;携带Apoptin双调控溶瘤腺病毒治疗肝癌的研究[D];浙江理工大学;2010年
7 胡徐庞;携带IL-24的嵌合型溶瘤腺病毒对淋巴癌细胞的研究[D];浙江理工大学;2011年
8 李仁举;一氧化氮对膀胱癌组织特异性溶瘤腺病毒基因治疗的作用[D];兰州大学;2011年
9 余越美;双调控携带IL24基因的溶瘤腺病毒靶向结肠癌的抗癌研究[D];浙江理工大学;2013年
10 肖连立;携带IL-24基因的E1区双调控溶瘤腺病毒治疗肿瘤的研究[D];浙江理工大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026