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《华中科技大学》 2011年
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白藜芦醇对恶性黑素瘤抗癌机制的实验研究

李东升  
【摘要】:恶性黑素瘤(MM)是来源于黑素细胞的皮肤恶性肿瘤。尽管近年来MM的基础及临床研究均取得一定进展,但迄今为止,对已经转移的中晚期MM患者仍缺乏有效的治疗药物及方法。深入探讨MM发生发展的内在机制,探寻新的治疗药物及治疗靶点是皮肤病研究工作者面临的挑战。近年来研究表明白藜芦醇对包括MM在内的多种肿瘤细胞均有显著的抑制作用,白藜芦醇可抑制培养的和新鲜分离的MM细胞的增殖,但对其抗肿瘤活性的确切机制尚不清楚。本研究通过体外实验初步研究了白藜芦醇对MM细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响及相关机制,进而对MM局部RAS系统诱导血管新生的机制进行了初步探讨,并且通过体外实验观察白藜芦醇对MM细胞局部RAS系统及血管新生的影响。 第一部分白藜芦醇对恶性黑素瘤细胞生长的影响及机制 背景和目的:白藜芦醇是(resveratrol)一种主要存在于种子植物中的植物补体,属于非黄酮类多酚化合物,具有保护心血管、抗炎、调节血脂、抑制血小板聚集等多种功效。近来研究证明其具有确切的抗肿瘤作用,在肿瘤的起始、促进、发展三个阶段均有抑制作用,被认为是最有希望的天然化学防癌剂之一。既往报道白藜芦醇对包括恶黑在内的等多种肿瘤细胞均有显著的抑制作用,近期研究显示白藜芦醇可抑制培养的和新鲜分离的恶黑细胞的增殖,但对其确切机制尚不清楚。本研究通过体外实验观察白藜芦醇对恶黑细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响,探讨其抗恶黑细胞生长作用的分子机制,为其作为抗恶黑药物的应用提供理论及实验依据。 方法:采用MTT法检测白藜芦醇对人恶性黑素瘤细胞系A375及小鼠恶黑细胞系B16-F1增殖的影响;Annexin-V/PI双标流式细胞术检测白藜芦醇对A375、B16-F1细胞凋亡的影响,PI单标流式细胞术测定白藜芦醇对A375、B16-F1细胞DNA分布的影响;Western印迹法检测白藜芦醇对A375细胞Bcl-2、Bax、cyclinDl及p21蛋白表达的影响。 结果:白藜芦醇对A375、B16-F1细胞具有明显的抑制增殖作用,其抑制增殖作用呈量效及时效关系。25μmol/L白藜芦醇作用24h即可诱导A375细胞凋亡,其细胞凋亡率为(16.7±2.1)%;100gmol/L白藜芦醇作用24h时B16-F1细胞凋亡率可达(39.6±3.3)%。100μmol/L白藜芦醇作用12h时A375细胞凋亡率为(17.2±1.7)%,作用72h时细胞凋亡率则高达(52.3±4.1)%;相同浓度白藜芦醇作用12h时B16-F1细胞凋亡率为(18.4±1.6)%,作用72h时细胞凋亡率则可达(56.7±4.5)%。白藜芦醇处理组A375及B16-F1细胞周期均发生变化,细胞周期被阻滞于G1期。此阻滞效应随白藜芦醇浓度的增加而增加:25gmol/L白藜芦醇作用24h时A375及B16-F1细胞G1期比例分别为(40.51±3.97)%、(41.34±3.12)%,100μmol/L白藜芦醇作用相同时间时其G1期比例分别为(55.64±4.95)%、(53.93±5.12)%。白藜芦醇明显下调A375细胞抗凋亡蛋白Bcl-2及细胞周期蛋白cyclinDl的表达,同时上调促凋亡蛋白Bax及p21蛋白的表达水平。 结论:白藜芦醇可通过调控细胞周期进程、诱导细胞凋亡而有效抑制恶性黑素瘤细胞生长,其调控细胞周期及诱导细胞凋亡的机制分别与调节细胞周期蛋白cyclinD1/p21及凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的表达有关。 第二部分血管紧张素Ⅱ在恶性黑素瘤细胞的表达及对血管新生的影响 背景和目的:传统认为,肾素-血管紧张索系统(RAS)主要功能是对机体的血压和水电解质平衡的调控,近年研究发现许多组织中都存在“局部RAS”,参与机体炎症、纤维化、细胞增殖及凋亡等多种生理及病理性进程。RAS主要效应肽是血管紧张素Ⅱ(AngⅡ), AngⅡ有两种特异性受体:血管紧张素Ⅰ型(AT1R)和Ⅱ型受体(AT2R)。研究证实RAS主要是通过AngⅡ/AT1R途径发挥其生物学活性。近期研究表明,RAS参与部分肿瘤的发生发展,但具体机制未完全阐明。本实验对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在恶黑细胞的表达情况进行了初步探讨,并进一步研究AngⅡ对恶黑细胞血管新生的影响。 方法:分离并培养正常人黑素细胞及原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC),放免法检测人恶黑细胞株A375及人正常黑素细胞培养上清液中AngⅡ的表达水平,体外小管形成实验检测AngⅡ对HUVEC体外小管形成的影响,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测A375细胞分别在AngⅡ及血管紧张素Ⅱ受体1(AT1R)特异性拮抗剂洛沙坦作用前后血管内皮细胞生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达。 结果:人恶黑细胞株A375细胞培养上清液中AngⅡ表达水平为37.29±0.27 pmol·L-1,较人正常黑素细胞(21.58±0.32 pmol·L-1)明显增高,差异有显著性(P0.05);AngⅡ能明显诱导HUVEC管状结构的形成,1×10-6mol/L AngⅡ处理后,二维基质胶中HUVEC形成完整的管状结构,其面积明显高于对照组,为对照组2.5±0.3倍,差异有显著性(P0.05);1×10-6mol/LAngⅡ处理后,VEGF及bFGF在A375细胞mRNA及蛋白水平的表达较处理前明显增高,洛沙坦(1×10-6mol/L)作用后则正好相反,差异有显著性(P0.05)。 结论:恶黑存在着局部RAS的表达异常(AngⅡ的超表达),AngⅡ能明显促进恶黑细胞的血管新生,这可能是局部RAS影响恶黑肿瘤发生的机制之一 第三部分白藜芦醇下调局部RAS系统的表达抑制恶性黑素瘤血管新生的实验研究 背景和目的:既往研究及本实验前期研究均表明MM存在有RAS的超表达,过高表达的RAS能明显促进恶黑细胞的血管新生。另有研究表明,肾素-血管紧张素转换酶抑制剂(angiotension converting enzyme inhibitors,ACEI)除被广泛应用于高血压治疗外,还能抑制部分肿瘤细胞的生长。近期研究发现,白藜芦醇具有ACEI舌性,提示除了对肿瘤细胞增殖、凋亡影响外,白藜芦醇可能具有不同于其他抗肿瘤药物的特性和机理。本实验初步探讨白藜芦醇对恶黑AngⅡ/AT1R表达的影响,进一步研究白藜芦醇是否通过对AngⅡ/AT1R的调控抑制恶黑血管新生,以期为白藜芦醇对恶黑的抗癌效应找到新的实验及理论依据。 方法:放免法检测白藜芦醇对人恶黑细胞株A375细胞培养上清液中AngⅡ的表达水平的影响,RT-PCR及Western印迹法检测白藜芦醇对A375细胞AT1R表达的影响。体外小管形成实验检测白藜芦醇对HUVEC体外小管形成的影响,Western印迹法检测白藜芦醇对A375细胞VEGF及环氧合酶-2(COX-2)表达的影响。 结果:(1)100μmol/L白藜芦醇作用24h后,人恶黑细胞株A375细胞培养上清液中AngⅡ表达水平较对照组差异无统计学意义(P0.05);(2)100μmol/L白藜芦醇作用24h后,ATlR在A375细胞mRNA及蛋白水平的表达较对照组明显降低,差异有显著性(P0.05)。(3)白藜芦醇能明显抑制HUVEC管状结构的形成,100μmol/L白藜芦醇处理后,二维基质胶中HUVEC形成不完整的、松散的管状结构,小管的直径及面积均明显低于对照组(P0.05)。(4)白藜芦醇能明显下调A375细胞VEGF及COX-2的表达,且呈量效及时效关系。与对照组相比,25μmol/L白藜芦醇作用24h后,VEGF及COX-2的表达即呈现下调(P0.05),100μmol/L白藜芦醇作用24h后,则下调更为明显(P0.01);100μmol/L白藜芦醇作用6h后即可下调VEGF及COX-2的表达(P0.05),24h后更明显(P0.01)。 结论:白藜芦醇参与对MM局部RAS的调控。其调控机制不是通过其ACEI效应,而是通过抑制ATlR的表达来实现的。白藜芦醇能明显抑制血管生长因子VEGF及COX-2的表达并能明显抑制MM血管新生,提示白藜芦醇可能是通过对ATlR的下调进而影响恶黑的血管新生从而发挥其抗癌效应。
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