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《华中科技大学》 2011年 博士论文
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核素报告基因显像监测大鼠脑梗死模型中移植的转基因干细胞的实验研究

吴涛  
【摘要】:目的 通过不同的移植途径(原位移植、脑室移植、颈动脉移植、尾静脉移植)将转基因干细胞移植入大鼠脑梗死模型中,采用生物分布、放射自显影、分子生物学及免疫组织化学的方法,在体外间接监测大鼠脑梗死模型中目的基因的表达水平及放射性计数,分析放射性计数与基因表达水平之间的相关性,获得最佳的细胞移植途径及显像的最佳条件。然后采用单光子发射计算机断层扫描仪和小动物正电子发射断层扫描仪进行活体显像,为活体监测细胞及基因治疗疗效提供实验基础。 方法 1.SD大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定 取4周龄的SD大鼠一只,无菌条件下分离双侧股骨和胫骨,去净软组织后,剪开干骺端,用无血清培养基冲洗骨髓腔,收集冲洗液进行离心,1 OOOrpm/min离心5min,弃上清后用含10%胎牛血清的培养基重悬接种到六孔板内,三天进行一次换液,待生长到80%融合时进行消化传代。取3-4代的细胞进行爬片处理,采用免疫组化的方法对其表面抗原CD34、CD44进行鉴定。 2.大鼠脑梗死模型的建立及评定 采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞模型,麻醉状态下分离大鼠左侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉,结扎颈总动脉和颈外动脉,于颈总动脉上剪一个小口,将线栓插入到颈内动脉,进入深度距颈内颈外分叉处18mm,阻塞1h后拔出线栓进行再灌注。通过行为学及TTC染色来判定模型成功与否。 3.细胞准备 取4-6代处于指数生长期的细胞,按照每孔5×105的密度接种到六孔板,待生长到80%融合时进行病毒感染,感染复数为150,培养箱内孵育2h后换液,继续培养24h后进行消化,移植备用。 4.细胞移植 本研究中,在脑梗死24小时后于立体定位仪上进行细胞移植。每只大鼠均移植2×106个转基因的干细胞,移植细胞重悬体积为15~20μl,生物分布实验中,根据不同的移植途径分组如下:①原位移植组(n=5);②侧脑室移植组(n=5);③颈动脉移植组(n=5);④尾静脉移植组(n=5);⑤以正常大鼠为对照组(n=4)。参考诸葛启钏主译的第三版《大鼠脑立体定位图谱》,梗死侧原位注射点体外标记为前囟前lmm,旁开3mm,进针5mm;侧脑室移植体表标记为前囟后lmm,旁开1.5mm,进针3.5mm;动脉移植采用脑梗侧颈内动脉内注射,移植完毕后结扎动脉血管近心端。放射自显影和活体显像均只采用原位注射途径进行细胞移植。 5.报告探针的核素标记 采用Iodogen固相氧化法进行FAU的131Ⅰ标记,标记产物经C-18小柱甲醇纯化,测定标记率和放化纯,并测定纯化产物在新鲜人血清和PBS中24h的稳定性。采用西门子公司的自动合成模块进行合成标记18F-FHBG。 6.生物分布 每只大鼠尾静脉注射1.11MBq纯化后的标记物,24h后处死动物,分别取梗死侧脑组织、对侧脑组织、甲状腺、肺、心肌、肝脏、胃、胰腺、脾、肾、肌肉、骨骼、血液和小肠,称湿重并测量放射性γ计数,经放射性衰减校正后,计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g),并计算梗死侧脑组织与血液放射性计数的比值。 7.实时定量PCR 分别提取每组梗死侧和对侧脑组织中TK基因的总RNA,按照Ferments说明书进行逆转录合成cDNA。引物:上游5'-CTCACCCTCATCTTCGACCG-3',下游5'-CCTGCAGATACCGCACCGTA-3'。按照上述引物于实时定量PCR仪上扩增45个循环,总反应体系为10μL。利用2-△△CT方法分析不同组间目的基因表达的相对量(CT)。 8. Western-blot蛋白测定 往组织中加入裂解液后进行研磨直至组织完全裂解,移至离心管后12000rpm、4℃离心5min,取上清进行蛋白定量测定。测定完毕后进行SDS-PAGE凝胶电泳,根据蛋白Marker指示终止电泳进行转膜,此时开始染色并加入抗体进行免疫反应,完毕后取出膜进行ECL发光、显影和定影。用计算机图形分析软件自动分析图形的大小和灰度。每组实验均重复3次。 9.放射自显影和荧光照相 细胞移植按照上述方法进行,只采用原位注射的途径。分组如下:①正常大鼠注射131I-FIAu;②脑梗死模型大鼠注射131I-FIAU:③脑梗死模型大鼠注射131Ⅰ;④移植转基因干细胞的脑梗死模型注射131I-FIAU.分别于131I-FIAU注射后2h、12h、24h和48h处死动物,取脑后立即行冰冻切片,层厚15μm。然后按照说明书进行放射自显影。 10.SPECT显像 按照不同的移植途径将细胞移植入大鼠脑梗死模型中,每只模型移植2×106个细胞,每只大鼠注射0.3mCi131I-FIAU,分别于不同的时间进行SPECT显像,放大2倍,矩阵512×512,采集计数120k。 11.Micro-PET/CT显像 将细胞在立体定位仪上定向注射到模型脑组织中,分组如下:①脑梗死模型内移植转基因干细胞并注射18F-FHBG:②脑梗死模型内移植正常细胞并注射18F-FHBG;③正常大鼠脑内移植转基因干细胞并注射18F-FHBG:④脑梗死模型直接注射18F-FDG.动物采用气体麻醉后,置于Micro-PET/CT机上进行显像。 12.资料统计 所有数据均采用均数±标准差(x±s)表示,数据统计采用SPSS11.5软件进行分析,以p0.05为差异具有统计学意义。 结果 1.BMSCs的培养鉴定 经过4代的培养,细胞基本纯化,呈梭形集落样生长,免疫组化鉴定细胞表面抗原CD34表达阴性,CD44表达阳性,证明该方法所获得细胞为骨髓间充质干细胞。 2.大鼠脑梗死模型的评定 对动物模型的评定采用5分制,所有实验均选择评分在1-3分之间的动物模型,因为该分值范围内的模型最稳定,死亡率最低,各部分实验的组间差异没有统计学意义,P0.05。TTC染色结果显示,梗死区脑组织未染色呈白色,而正常脑组织区域被染成深红色,说明线栓法造模成功。 3.放射性探针的标记 131I-FAU标记率为60.83±1.48%,放化纯为98.01±0.56%,标记产物在人血清及PBS中24小时的稳定性分别为96.12±0.84%和94.74±0.42%。18F-FHBG的标记率和放化纯分别为34.86±2.41%和99.53±0.27%。 4.生物分布 所有移植细胞组内两侧脑组织%ID/g的差异具有统计学意义(t=9.00~15.73,P=0.000~0.003),而对照组差异不明显(t=1.51,P=0.182)。组间脑梗死侧脑组织的%ID/g采用单因素方差分析,所有组与对照组之间的差异显著,有统计学意义(P均0.001),原位移植组与其它各组间的差异具有统计学意义(P=0.000-0.027),脑室移植组、动脉移植组与尾静脉移植组组间差异不明显,无统计学意义(P=0.064~0.662)。 5.实时定量PCR 所有移植细胞组内两侧脑组织TK基因表达相对量之间的差异具有统计学意义(t=26.14-122.44,P均0.001),对于梗死侧脑组织中TK基因的表达量,原位移植组与其它各组间的差异具有统计学意义(P=0.000~0.014),其它三组组间差异不明显,无统计学意义(P=0.112~0.364)。采用Pearson相关分析方法,脑组织中TK基因表达的相对量与每克组织百分注射剂量率呈正相关,r=0.971,P0.001。 6.Western blotting 所有移植细胞组内两侧脑组织内TK/β-actin比值的差异具有统计学意义(t=33.10~117.87,P均0.001)。对于组间脑梗死侧脑组织内的TK/β-actin的比值,原位移植组与其它各组间的差异具有统计学意义(P=0.011-0.016),其它各组组间差异不明显,无统计学意义(P=0.141~0.462)。采用Pearson相关分析方法,脑组织内TK/β-actin的比值与每克组织百分注射剂量率呈正相关,r=0.899,P=0.002。 7.放射自显影 放射自显影图像显示,在所有实验组中,梗死侧即注射细胞侧脑组织较周围组织和对侧脑组织有明显的放射性浓聚,差异具有统计学意义,P0.05,而在对照组内两侧脑组织的放射性分布未见明显差异,P=0.131~0.552。脑组织内的灰度值随着时间的延长而逐渐减低,实验组内双侧脑组织的灰度比值在24小时达到峰值(6.63)。 8.活体显像 在SPECT图像上,不能够清晰的分辨大鼠脑组织结构。18F-FDG Micro-PET/CT显像可以显示脑梗部位的放射性分布明显减低;在梗死模型大鼠原位注射转基因干细胞后,18F-FHBG显像显示在细胞注射部位有明显的放射性浓聚。 结论 生物分布和放射自显影实验证明131I-FIAU/TK报告基因系统监测脑梗死模型中移植的转基因骨髓间充质干细胞切实可行,并且报告基因与治疗基因的表达量呈很好的正相关,原位移植是基因治疗脑梗死最佳的细胞移植途径。SPECT舌体显像,由于分辨率较低,不能很好的显示大鼠脑组织结构,而Micro-PET/CT可以清晰地监测到移植细胞的位置,并可以评价基因治疗的疗效,为活体监测移植细胞的存活、转归及疗效提供了实验基础。


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