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《华中科技大学》 2011年
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聚集素蛋白(Clusterin)在心脏移植冷缺血再灌注损伤中的保护作用与机理研究

李舒媛  
【摘要】:第一部分供体心脏表达clusterin显著降低同基因心脏移植的冷缺血再灌注损伤 [目的]心脏移植中冷缺血保存和随后的热灌注损伤统称为冷缺血再灌注损伤,是引起移植物失功的初始因素,而且还可以导致移植心脏冠状血管病。Clusterin是具有细胞保护功能的伴侣蛋白,几乎在所有哺乳动物组织中表达,具有参与生殖、脂质转运、抑制补体激活和调节凋亡等多种作用。本实验拟探讨供体心脏表达的clusterin在同基因心脏移植冷缺血再灌注损伤中的保护作用及机制。 [方法]RT-PCR和免疫组化染色检测野生型C57BL/6J小鼠(WT B6)和clusterin基因敲除小鼠(CLU-KO,C57BL/6J)心脏组织中的clusterin表达;分别取上述两组小鼠的心脏,在4℃生理盐水中保存8h,然后行同基因腹部异位心脏移植;移植前,分别检测保存8h后两组保存液中心肌细胞释放的肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)含量;移植后15min和24h行心脏移植物评分,评估移植心脏功能;HE染色观察两组心脏移植物病理变化;免疫组化检测两组心脏移植物内髓过氧化物酶(MPO)的表达情况,原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL法)检测两组心脏移植物内的细胞凋亡情况。 [结果]RT-PCR证实WT B6小鼠心脏组织组成性的表达clusterin,免疫组化染色发现,clusterin蛋白主要表达在血管内皮组织和心肌细胞表面,而CLU-KO小鼠心脏内未见clusterin表达。与CLU-KO组相比,WT B6组心脏在4℃生理盐水中保存8h后,保存液中CK和LDH的释放量显著降低(CK:784.25±90.71 U/L VS610.96±60.02UL,p=0.0226;LDH:0.744±0.129 VS 0.548±0.076,p= 0.0134)。移植后15mmin和24h,WT B6组心脏移植物评分分别为2.3和3.5,而CLU-KO组心脏移植物评分则分别为1和3,两者相比,差异显著,有统计学意义(p=0.002;p=0.0271)。HE染色证明,WT B6组心脏移植物血管周围炎性反应、淋巴细胞浸润和心肌细胞的坏死均比CLU-KO组减轻。MPO染色和TUNEL检测发现,WT B6组心脏移植物MPO阳性细胞数和凋亡细胞数较CLU-KO组均显著减少(p=0.0002;p=0.0316)。 [结论]供心表达clusterin能显著降低心脏移植过程中冷缺血再灌注损伤。因此,上调供移植心脏中的clusterin表达可能具有保护供心并降低冷缺血再灌注损伤的潜能。 第二部分Clusterin在心肌细胞冷保存损伤中的保护作用及机制 [目的]在第一部分实验中已经证实:供心表达clusterin后能减轻冷缺血再灌注损伤。但是,clusterin表达后通过何种机制降低冷缺血再灌注损伤,特别是冷保存损伤,目前尚不清楚。本实验拟分离clusterin基因敲除(CLU-KO)小鼠心肌细胞,并转入clusterin基因,使心肌细胞表达clusterin,在体外进一步研究clusterin在心肌细胞冷保存损伤中的保护作用及机制。 [方法]分离培养CLU-KO小鼠的心肌细胞,经RT-PCR鉴定后,将永生化SV40基因转入心肌细胞,建立小鼠心肌细胞系(MHC)。分别将pHEX6300或pHEX6300-CLU转染入MHC,获得MHC-Con和MHC-CLU两种细胞,Western Blot检测转染后两组心肌细胞clusterin蛋白的表达;两组心肌细胞在4℃生理盐水中保存6~8h,分别在不同时间点检测两组保存液中心肌细胞的LDH释放量和细胞膜流动性的改变。 [结果]分离培养的小鼠心肌细胞,经RT-PCR鉴定证实,α-心肌肌球蛋白重链(a-MHC)和间隙连接蛋白43 (connexin 43)表达阳性,而β-心肌肌球蛋白重链(β-MHC)和α-骨骼肌肌动蛋白(a-skeletal actin)表达则为阴性。SV40永生化的小鼠心肌细胞转染pHEX6300或pHEX6300-CLU后,Western Blot检测证明,MHC-CLU表达clusterin蛋白,而MHC-Con未见clusterin蛋白表达。两组心肌细胞在4℃生理盐水中保存8h后,MHC-CLU组释放的LDH量从1h的22.66±7.53%升高到8h的28.24±1.78%,而MHC-Con组则从1h的31.39±3.42%升高到8h的92.16±4.07%,两组间比较,差异显著,有统计学差异(p0.0001)。两组心肌细胞在4℃生理盐水中保存6h后,MHC-CLU膜稳定性与Oh相比增加了30%,而MHC-Con则降低了15%。 [结论]心肌细胞表达clusterin后,通过稳定细胞膜,防止冷保存中心肌细胞膜的破裂,并降低心肌细胞LDH释放,进而抑制心肌细胞坏死,发挥保护作用。 第三部分重组的clusterin蛋白(rCLU)在心脏移植冷缺血再灌注损伤中的保护作用及机制 [目的]前两部分的研究结果证明:(1)供心表达clusterin能显著降低心脏移植过程中冷缺血再灌注损伤;(2)心肌细胞表达clusterin后,通过稳定细胞膜,防止冷保存中心肌细胞膜的破裂,并降低心肌细胞LDH释放,进而抑制心肌细胞坏死,发挥保护作用。本研究拟构建重组的clusterin蛋白(rCLU),并将其加入UW保存液中,探讨rCLU在人内皮细胞系以及小鼠心脏移植中能否发挥抵御冷缺血再灌注损伤的作用及其潜在的作用机制。 [方法]体外合成rCLU并经Western Blot鉴定。(1)体外实验:用含不同浓度rCLU的4℃UW液分别保存人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和肾小球内皮细胞(HRGECs);冷保存24h后,分别检测两种细胞的LDH释放量,以确定合适的rCLU浓度。上述两种内皮细胞分别在含lmg/ml rCLU的4℃UW液中保存24h,以相同浓度的牛血清白蛋白(BSA)为阳性对照,FDA-EB法检测两种内皮细胞的死亡率;流式细胞仪检测]-CLU在两种细胞表面的结合率;在不同时间点检测上述保存体系中,两种内皮细胞细胞膜的流动性改变。(2)体内实验:以C57BL/6J小鼠心脏作为供体,在含1mg/ml rCLU的4℃UW液保存24h,以相同浓度的BSA为阳性对照,不同时间点检测保存液中心脏释放的LDH量;供心保存24h后,行同基因腹部异位心脏移植。参照第一部分的实验方法,移植后15min和24h行心脏移植物评分,评估移植心脏功能;移植后24h,行HE染色检测心脏移植物病理学变化;免疫组化染色检测心脏移植物内MPO的表达;TUNEL法检测心肌细胞的凋亡情况。 [结果]Western Blot鉴定结果说明合成的rCLU为异二聚体。体外实验证明,1mg/ml rCLU的4℃UW液与相同浓度的BSA相比,前者能显著降低HUVECs冷保存过程中的LDH释放(29.49±6.07% VS88.27±8.3%, P=0.0039); FDA-EB染色半定量计数亦表明,1mg/ml rCLU的4℃UW液能降低冷保存体系中HUVECs的坏死率;流式细胞术检测证明,rCLU能够结合在HUVECs细胞膜表面,增加细胞膜的流动性;而相同情况下处理的HRGECs,我们也得到了类似的结果。体内实验证实,1mg/ml rCLU的4℃UW液能显著降低小鼠供心在冷保存过程中的LDH释放;心脏移植后,rCLU能有利于心脏移植物功能的恢复并降低血清中CK和LDH值,同时亦能减轻移植物中血管周围炎症、中性粒细胞的浸润以及心肌细胞的坏死和凋亡 [结论]rCLU能保护供移植器官,减轻其冷保存损伤。因此,在UW液中加入rCLU有望作为一个新的策略,优化供移植器官组织或细胞的冷保存方案。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R654.2

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈平;袁耀宗;;簇素在急性胰腺炎发病机制中的研究进展[J];国际消化病杂志;2006年01期
2 王元天;抑制前列腺癌细胞凋亡的特异介质-Clusterin[J];国外医学.泌尿系统分册;2003年02期
3 付桂莉,许成蓉;聚集素与细胞凋亡关系的研究进展[J];临床口腔医学杂志;2004年09期
4 赵颖;牛膺筠;;Clusterin与视网膜疾病[J];临床眼科杂志;2006年02期
5 陈金元;李杰;徐宏;;Clusterin和Survivin在大肠癌中的表达及意义[J];中国热带医学;2008年12期
6 齐越,张强,张志文;新的抗细胞凋亡因子——Clusterin研究新进展[J];生物学通报;2001年08期
7 牛林琳;蔡莉;;Clusterin的研究进展及其在肺癌中的研究现状[J];实用肿瘤学杂志;2007年01期
8 刘燕青;韩威;王刚;孙保存;;Clusterin结构特点及其与肿瘤发生、发展的关系[J];武警医学;2008年10期
9 马建芳;陈生弟;;聚集素蛋白与神经变性疾病[J];中国现代神经疾病杂志;2006年04期
10 JUNG-HYUNPARK,JEE-SUNPARK,SUNG-KYUJU,KWAN-BOKLEE,KWAN-HEEYOU,MYUNG-HEEKANG,Yoo-KYOUNGPARK,SHIN-YOUNGNA;Clusterin mRNA expression in apoptotic and activated rat thymocytes[J];Cell Research;2003年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前9条
1 史子学;孙金福;郭焕成;涂长春;;猪瘟病毒感染猪白细胞凋亡基因表达谱变化的研究[J];病毒学报;2008年06期
2 王蓓;洪震;;聚集素基因和聚集素在阿尔茨海默病研究中的进展[J];中国临床神经科学;2011年04期
3 张建举;于跃利;杜颖;;Clusterin在肿瘤中的研究进展[J];内蒙古医学杂志;2011年04期
4 欧贤红;廖柳凤;刘华钢;徐恒;;POLD1基因在原发性肝癌中的表达及其意义[J];世界华人消化杂志;2011年02期
5 石磊;孙鲁宁;顾鹏毅;卢杰;李琳;黄长荣;费菲;王珏;;载脂蛋白J在实验性脑缺血再灌注大鼠脑内的表达[J];中风与神经疾病杂志;2011年10期
6 张博;金铮;别黎;赵刚;;晚发性阿尔茨海默病全基因组关联研究进展[J];中华临床医师杂志(电子版);2012年05期
7 梁杰;吴泽勇;罗少军;;Caspase-3与Clusterin在血管瘤组织中的表达及其相关性研究[J];中国实用医药;2008年10期
8 韩凌;冯森玲;李莎莎;孙静;罗国安;;真武汤对单侧输尿管梗阻模型大鼠尿KIM-1、clusterin、OPN含量的影响[J];中药药理与临床;2012年01期
9 赵艳利;张会娟;陈景斌;;凋亡相关蛋白HSP90α和Clusterin在自身免疫性甲状腺疾病中的表达[J];中国现代医学杂志;2012年32期
中国博士学位论文全文数据库 前5条
1 王蓓;CLU基因多态性及clusterin与阿尔茨海默病和轻度认知损害的相关性研究[D];复旦大学;2011年
2 王莹;利用蛋白质组学技术研究Z24的肝毒性作用机制[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
3 史子学;猪瘟病毒感染猪外周血白细胞转录组变化的研究[D];吉林大学;2009年
4 王瑞娟;IL-11调控中子辐射肠上皮细胞损伤的ERK和PI3K/Akt信号转导机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2009年
5 李瑾宜;雄激素在肾结石形成过程中作用的研究[D];第二军医大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 彭华;Clusterin和GRP78在胶质瘤中的表达及其与临床病理特征之间的关系[D];川北医学院;2011年
2 肖小旺;Clusterin蛋白在男性不育症睾丸组织中的表达及意义[D];中南大学;2011年
3 杨柳;老年认知障碍的危险因素及社会心理研究[D];复旦大学;2011年
4 赵庆;~(18)F-SFB-Annexin B1探测细胞凋亡的实验评价[D];复旦大学;2010年
5 都文婕;肽抑制剂稳定淀粉样蛋白构象的分子机理研究[D];天津大学;2010年
6 高林;淀粉样蛋白对不同年龄大鼠脑内乙酰胆碱代谢酶和神经新生的影响[D];郑州大学;2006年
7 石磊;载脂蛋白—J mRNA在实验性急性脑出血大鼠脑内的表达[D];中国医科大学;2008年
8 陈逸群;EUK4010对Presenilin-1/Presenilin-2双基因敲除小鼠神经退行性病变的影响及其机理的研究[D];华东师范大学;2009年
9 王守育;旋毛虫43ku ES抗原基因与保姆细胞形成相关性的研究[D];东北农业大学;2009年
10 柳文清;酵母双杂交系统筛选IEX-1相互作用蛋白的研究[D];中南大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前8条
1 陶凌,李源,高峰,王跃民,龚卫琴;缺血后处理对急性心肌缺血再灌注兔心脏的保护作用[J];第四军医大学学报;2000年06期
2 高志成;陈蓉;邹平;;Clusterin在大肠癌细胞中的抗凋亡作用[J];泸州医学院学报;2007年05期
3 高吴阳,胡传义,易慕华;survivin蛋白在前列腺癌中的表达及其与肿瘤细胞凋亡的关系[J];中华男科学;2004年01期
4 张诗武;张丹芳;金孟珏;贾兴红;朱悦;赵秀兰;孙保存;;人乳腺癌预后COX风险比例模型分析及Clusterin表达相关意义[J];中华肿瘤防治杂志;2007年17期
5 杜心灵,叶亮,夏家红;重组人红细胞生成素对大鼠心肌梗死的治疗作用[J];中华实验外科杂志;2004年11期
6 柯俊;孙宗全;付平;;Cariporide对离体鼠心缺血再灌注损伤的保护作用[J];中华实验外科杂志;2006年12期
7 张徽,刘纯,李圆圆;47例甲状腺癌中FasL检测的病理学意义[J];重庆医科大学学报;2003年01期
8 Jonathan S.T.Sham;Sze Hang Lau;;Oncogenic role of clusterin overexpression in multistage colorectal tumorigenesis and progression[J];World Journal of Gastroenterology;2005年21期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张璞;李涛;刘进;;含聚合血红蛋白的St.Thomas液对低温保存离体大鼠心脏的保护作用[J];四川大学学报(医学版);2010年03期
2 忻元峰;汪进益;范慧敏;刘泳;张涛;刘中民;;腺苷预处理对大鼠心脏移植缺血再灌注损伤心肌的保护作用[J];中国比较医学杂志;2008年07期
3 兰纲;杨康;吴蔚;白云;蒋彬;李军;熊刚;;CVF在大鼠移植心脏缺血再灌注损伤中的保护作用研究[J];第三军医大学学报;2007年04期
4 李明;李幼平;严律南;;大鼠移植心慢性失功加快模型的建立[J];重庆医科大学学报;2006年01期
5 吴龙,孙宗全;小鼠心脏移植缺血再灌注诱导细胞凋亡的机制[J];中国心血管杂志;2004年05期
6 ;心脏外科学[J];国外科技资料目录(医药卫生);2002年10期
7 于建宪,崔晶,姜长青,池一凡,侯文明;猪心脏移植缺血再灌注损伤中NO和NOS的表达[J];齐鲁医学杂志;2004年06期
8 邹定全,常业恬;基因芯片技术在心肌缺血再灌注损伤研究中的应用[J];国外医学.麻醉学与复苏分册;2005年04期
9 杨邦祥;李羽;;犬心脏移植围术期血清IL-6、IL-8、TNF-α的变化[J];四川医学;2008年01期
10 高文波,朱有华;心脏保存液的研究现状[J];国外医学.外科学分册;2005年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 忻元峰;汪进益;刘中民;范慧敏;刘泳;张涛;;腺苷预处理对大鼠心脏移植缺血再灌注损伤心肌保护作用研究[A];中华医学会第七次全国胸心血管外科学术会议暨2007中华医学会胸心血管外科青年医师论坛论文集心血管外科分册[C];2007年
2 何靖康;于曙东;马海涛;郑世营;倪斌;秦涌;顾振纶;;前列腺素A1对供心缺血再灌注损伤的保护作用及分子机制研究[A];第八届华东六省一市胸心血管外科学术会议论文汇编[C];2005年
3 张晓慎;吴若彬;郭惠明;;供心缺血-再灌注损伤心肌细胞凋亡与心功能变化[A];中华医学会第七次全国胸心血管外科学术会议暨2007中华医学会胸心血管外科青年医师论坛论文集心血管外科分册[C];2007年
4 黄健;;心脏移植术后排斥反应的观察和处理[A];全国心脏内外科专科护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2004年
5 许林海;;心脏移植进展[A];2005年浙江省器官移植学术会议论文汇编[C];2005年
6 李涛;张虹;李贵刚;胡维琨;;地塞米松对大鼠缺血再灌注损伤视网膜中葡萄糖转运蛋白—1表达的影响[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年
7 吴健;张毛毛;贾海波;张奇;黄幸涛;候静波;于波;;原苏木素A通过NF-κB信号通路靶向作用于T细胞抗鼠心脏移植免疫排斥的研究[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年
8 郑卫红;钱京萍;;阿斯咪唑对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的影响[A];第七届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2009年
9 韩杰;孟旭;孙凌波;张海波;贾一新;;25例心脏移植患者中期随访结果报道[A];中华医学会第七次全国胸心血管外科学术会议暨2007中华医学会胸心血管外科青年医师论坛论文集心血管外科分册[C];2007年
10 刘修恒;陈晖;詹炳炎;周江桥;祝恒成;陈志远;;缺血后处理对肾缺血再灌注损伤炎症的影响[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 张玲;诺基亚IP Clustering技术 降低防火墙的单点故障率[N];中国计算机报;2002年
2 本报记者 王雪敏;中国心脏移植的现状和进展[N];医药经济报;2010年
3 吴兴海 贾一新;我国心脏移植技术日趋成熟[N];中国医药报;2009年
4 武汉协和医院心外科主任 董念国 涂晓晨 吴惠亮 整理;心脏移植 期待快速发展[N];健康报;2011年
5 北京安贞医院 吴兴海 贾一新;安贞医院 成功移植心脏一百例[N];北京日报;2009年
6 李华虹 杨帆 记者 吴天飞;“心脏移植长期存活课题组”在哈成立[N];哈尔滨日报;2009年
7 记者 吴伟农;美心脏移植病人状况好转[N];新华每日电讯;2001年
8 ;血检可判断心脏移植是否排异[N];大众卫生报;2000年
9 胡瑶;心脏移植排异反应,也有“性别差异”[N];新华每日电讯;2008年
10 记者卢文洁 通讯员陈广泰;三甲医院方可做心脏移植[N];广州日报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李舒媛;聚集素蛋白(Clusterin)在心脏移植冷缺血再灌注损伤中的保护作用与机理研究[D];华中科技大学;2011年
2 焦爽;斑马鱼Clusterin基因的克隆、表达及调控研究和成肌细胞中IGFs表达调控机理的初步研究[D];中国海洋大学;2011年
3 刘凤鸣;巯甲丙脯酸停跳液对低温缺血再灌注离体兔心的保护作用[D];中国协和医科大学;1992年
4 曹泽玲;靶向PPARγ抗心肌缺血再灌注损伤的作用特征[D];中国人民解放军军医进修学院;2005年
5 金欢胜;HSP70介导肾脏缺血预适应保护作用的实验研究[D];第三军医大学;2005年
6 贺晓楠;腺苷对缺血再灌注心肌的保护作用[D];吉林大学;2007年
7 江浪清;缺血后处理对同种异体大鼠胰腺移植缺血再灌注损伤保护作用及其机制研究[D];中南大学;2008年
8 张召辉;缺血后处理对大鼠移植胰腺缺血再灌注损伤的保护作用及其机制的研究[D];第四军医大学;2009年
9 吴锦波;促红细胞生成素在大鼠心肌缺血再灌注损伤中的保护性作用研究[D];南方医科大学;2009年
10 王梦嵽;Exendin-4对大鼠皮质神经元缺血再灌注损伤后内质网相关性细胞凋亡的影响[D];华中科技大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李茵;肝癌血清潜在标志物Clusterin的质谱鉴定及细胞组织验证[D];广西医科大学;2012年
2 崔晶;猪心脏移植缺血再灌注损伤中NO、NOS表达的研究[D];青岛大学;2003年
3 韦克;亚低温对兔小肠缺血再灌注损伤保护作用的研究[D];广西医科大学;2005年
4 安肖霞;抑肽酶对肺缺血再灌注损伤保护作用的研究[D];浙江大学;2006年
5 高颖;兔心肌缺血与再灌注过程对心电图QRS合值及心肌酶的影响[D];新疆医科大学;2006年
6 李侠;异丙酚对肝脏缺血再灌注损伤保护作用的实验与临床研究[D];安徽医科大学;2007年
7 许建新;NF-κB抑制剂对大鼠肺移植缺血再灌注损伤的保护作用[D];福建医科大学;2008年
8 俞炜;甲基强的松龙在心内直视手术中的应用[D];山西医科大学;2009年
9 靖智利;七氟醚对大鼠急性肾缺血再灌注损伤的保护作用[D];中南大学;2009年
10 杨铁军;灯盏细辛对大鼠肾冷缺血再灌注损伤的保护作用及肾小管上皮细胞凋亡的影响[D];郑州大学;2005年
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