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《华中科技大学》 2011年
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纳米金电化学生物传感技术研究

夏玮  
【摘要】:生物传感器利用生物分子间可相互特异识别并结合的特性,可对被测物质实现高特异性分析,制备电化学生物传感器对满足生物医学研究和环境监测快速分析都具有十分重要的意义。纳米材料具有独特的物理和化学特性,具有促进电子传递和有助于保持生物分子活性的优点,因此,将纳米材料应用于生物传感技术检测方法的研究是一个很有前景的研究领域。 本论文利用纳米金颗粒作为修饰材料,分别构建了三种新型电化学生物传感器。首先,利用雌激素能与雌激素受体特异结合的特性,把雌激素受体固定到纳米金修饰的双层类脂膜中构建了用于检测雌激素类物质的传感器,并能对环境实际样品的总雌二醇当量实现快速灵敏的检测。其次,将纳米金、壳聚糖凝胶和酶标二抗混合溶液修饰电极,在电极表面形成了纳米敏感膜,成功构建了用于检测结核杆菌的酶免疫传感器。最后,利用带有氨基的纳米金在电极表面自动分散成膜,再固定ds-DNA于电极上,制成了用于检测环境遗传毒性污染物的生物传感器。 第一部分纳米金-双层类脂膜雌激素传感器检测环境样品中的雌激素类物质 目的:建立一种新型的基于纳米金修饰双层类脂膜雌激素生物传感器,可实现对环境样品中雌激素类物质的快速检测。方法:本方法基于雌激素与雌激素受体(ER)特异结合的特点,利用纳米金修饰双层类脂膜(s-BLM)后固定雌激素受体,建立一种新型的对雌激素类物质雌二醇当量进行快速检测的方法。以17β-雌二醇为检测对象,首先将双层类脂膜修饰铂盘电极,接着将纳米金用电沉积修饰到双层类脂膜中,再将雌激素受体(ER)固定在纳米金修饰的双层类脂膜(Au/s-BLM/Pt)中,制备成纳米金修饰双层类脂膜的雌激素生物传感器ER/Au/s-BLM/Pt,利用雌激素与敏感膜上雌激素受体结合前后电化学阻抗的改变来定量检测雌激素。电极的不同修饰状态分别用循环伏安法和交流阻抗法进行了表征。并利用该方法检测了双酚A和壬基酚等的类雌激素物质。将该传感器用于检测环境水样中的雌二醇当量(EEQ),结果与MCF-7细胞增殖实验相比较。结果:(Ⅰ)循环伏安法和交流阻抗法表征电极,验证了电极修饰状态良好;(Ⅱ)确定将ER固定在双层类脂膜上的最佳浓度为0.3 nmol/L及与17β-雌二醇的最佳结合反应时间为20min;(Ⅲ)定量研究获得该传感器对17β-雌二醇的剂量-反应关系曲线,以交流阻抗法测得17p-雌二醇与传感器反应后阻抗的改变与浓度在5~150 ng/L范围内呈良好线性关系,相关系数r=0.996,最低检出限为1 ng/L。(Ⅳ)利用该方法检测了其他的雌激素类物质双酚A和壬基酚,也在一定浓度范围内呈良好的线性关系。(V)将该法和无纳米金修饰的电极ER/s-BLM/Pt对17β-雌二醇的响应信号进行比较,纳米金起到了提高灵敏度和稳定性的作用;该传感器的重复性、选择性也较好。(Ⅵ)纳米金-双层类脂膜雌激素传感器对环境样本的检测结果与MCF-7细胞增殖实验结果基本一致,两个方法的回收率也良好。结论:该法对雌激素的检测,操作快速,选择性好,且纳米金增加了传感器的灵敏度和稳定性。结合有效的前处理过程,该法可以用于环境样品的定性与定量快速检测,可反映样品的总雌激素效应的雌二醇当量,与经典的生物检测方法MCF-7细胞增殖实验检测结果相当。 第二部分基于壳聚糖和纳米金的酶免疫传感器检测牛奶中结核杆菌 目的:本部分旨在建立一种基于壳聚糖和纳米金的酶免疫传感器能对结核杆菌进行定量检测的生物传感器,可作为快速检测牛奶样本中的结核杆菌的手段。 方法:本方法利用结核分支杆菌细胞壁的单克隆抗体能特异的结合结核杆菌这一特性,纳米金促进电子传递的特性将纳米金和壳聚糖混合作为承载反应原件的基质,建立一种新型的能对牛奶中的结核杆菌快速检测的方法。以牛分支结核杆菌卡介苗为检测对象,将壳聚糖凝胶、纳米金溶液和碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体混合溶液经电化学沉积法来修饰玻碳电极表面,再利用抗原抗体特异性反应将结核杆菌单克隆鼠抗体固定在碱性磷酸酶标记的羊抗鼠-壳聚糖-纳米金膜修饰的玻碳电极表面,制备用于检测结核杆菌的纳米结构的酶免疫传感器。通过差分脉冲伏安法测定传感器与结核杆菌反应前后引起的电流改变可定量分析。电极的不同修饰状态分别用循环伏安法和交流阻抗法进行表征。并将该法用于简单前处理牛奶样品的检测。结果:(Ⅰ)循环伏安法和交流阻抗法表征电极,验证了电极修饰状态良好;(Ⅱ)条件优化确定传感器与结核杆菌孵育的最佳时间为30 min,测试溶液最佳的pH值为8;(Ⅲ)以磷酸缓冲液配制不同浓度的结核杆菌,以差分脉冲伏安法测得传感器与结核杆菌结合反应后电流的改变与结核杆菌的浓度在104~106 cfu/mL范围内呈良好线性关系,相关系数r=0.994,最低检出限为3.5×103 cfu/mL。(Ⅳ)并证实了该传感器具有较好的重复性、选择性和稳定性。(Ⅴ)对灭菌后的牛奶加结核杆菌的样品前处理后进行检测,结果与磷酸缓冲液配制的结核杆菌样品基本一致。结论:该传感器制备方法简单,具有灵敏度高、检测时间短,操作简单等优点,是一种可快速检测结核杆菌的方法。 第三部分纳米金-DNA的电化学生物传感器检测环境水样的遗传毒性 目的:本部分旨建立一种基于纳米金-DNA的电化学生物传感器,可作为快速检测环境水样的遗传毒性的手段。方法:本方法利用油胺还原氯化金合成了表面带有氨基基团的纳米金颗粒,能在电极表面自动分散成膜,纳米金再吸附ds-DNA固定于电极表面,建立一种新型的能快速检测环境遗传毒性污染物的生物传感器。用紫外-可见光光谱和透射电镜表征纳米金结构和性质;以2-氨基蒽为标准品,利用方波伏安法测定传感器与样品反应后DNA鸟嘌呤峰电流高度发生的改变,可对2-氨基蒽进行定量检测。并将该传感器用于环境水样的检测,以鸟嘌呤的峰高改变来判断待测样品中是否具有遗传毒性,检测结果与单细胞凝胶电泳相比较。结果:(Ⅰ)紫外-可见光光谱和透射电镜表征纳米金,验证了纳米金状态稳定、均匀分散;(Ⅱ)定量研究获得该传感器对2-氨基蒽的剂量-反应关系曲线,以方波伏安法测得传感器与2-氨基蒽反应后鸟嘌呤峰电流的改变(S%)与2-氨基蒽的浓度在50 nM~1.25×103nM范围内呈良好线性关系,相关系数r=0.966,最低检出限为10 nM。(Ⅲ)用该传感器对前处理后的环境水样进行检测,结果与单细胞凝胶电泳相比较具有一定的相关性。结论:该传感器制备方法简单,具有灵敏度高、检测时间短,操作简单等优点,是一种可快速检测环境水样是否具有遗传毒性的方法。
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