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草酸钙尿石症患者肾脏组织中维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1的初步研究

胡波  
【摘要】:第一部分草酸钙尿石症患者肾脏组织中维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1(VKORC1)基因的表达研究 目的对维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1在草酸钙尿石症患者肾脏组织中的表达进行检测,探讨维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1(VKORC1)与草酸钙尿石形成之间的关联性。 方法收集2004年11月至2010年4月武汉同济医院肾脏组织标本155例,分成3组:结石组、对照组A(非结石性肾积水组)和对照组B(正常对照组),应用免疫组织化学分析法、免疫荧光显微镜检查法、蛋白质印迹法(western blot)和SYBR GreenI荧光实时逆转录聚合酶链反应(realtime RT-PCR)技术对肾脏组织中VKORC1蛋白进行定位和表达差异的研究。 结果免疫组织化学分析法和免疫荧光显微镜检查发现在结石组和对照组肾脏组织中都有VKORC1表达,主要存在于肾小管上皮细胞的细胞质内;蛋白质印迹法提示在结石组患者肾脏组织中VKOR1蛋白的表达(0.327±0.055)明显低于其他2个对照组(0.913+0.090、0.983+0.117),差异具有统计学意义(P0.05),对照组间的差异无统计学意义(P0.05); SYBR Green I荧光实时逆转录聚合酶链反应提示结石组患者肾脏组织中的VKORC1 mRNA (倍数:6.063±5.275)表达明显低于2个对照组(倍数:26.324±10.632、27.167±14.248),差异具有统计学意义(P0.05),对照组间的差异无统计学意义(P0.05)。 结论VKORC1主要在肾小管上皮细胞胞质内表达,草酸钙尿石症患者肾脏组织中VKORC1的表达降低,可能与草酸钙尿石的形成有关。 第二部分维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1(VKORC1)基因剪接异构体在草酸钙尿石症患者肾脏组织中的表达和鉴定 目的对维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1(VKORC1)基因剪接异构体在草酸钙尿石症患者肾脏组织中的表达和鉴定进行分析研究。 方法收集2004年11月至2010年4月武汉同济医院草酸钙尿石症患者肾脏组织标本65例,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法对肾脏组织中的VKORC1基因进行扩增,将PCR产物进行纯化回收后,通过直接测序和克隆测序的方法对得到的肾脏组织中VKORC1基因剪接异构体进行分析。 结果应用逆转录聚合酶链式反应的方法成功在草酸钙尿石症患者肾脏组织中扩增出VKORC1基因,并且得到2个剪接异构体,经过3%琼脂糖凝胶电泳显示一条约500bp的电泳条带(V1)和另一条约400bp的电泳条带(V2),经过测序鉴定后发现二者碱基序列相差110bp,二者其余序列完全一致。 结论草酸钙尿石症患者肾脏组织中存在VKORC1基因的剪接异构体。 第三部分草酸钙尿石症患者肾脏组织中维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1(VKORC1)基因3’-非翻翻译区(3,-UTR)和5,-非翻译区(5’-UTR)的扩增和鉴定 目的对草酸钙尿石症患者肾脏组织中维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1(VKORC1)基因的3’-非翻译区(3'-UTR)和5’-非翻译区(5'-UTR)进行扩增和鉴定,探讨维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1基因3’-非翻译区和5,-非翻译区的分子变异与草酸钙尿石形成之间的关系。 方法收集2004年.11月至2010年4月武汉同济医院草酸钙尿石症患者肾脏组织标本65例,提取肾脏组织中的总RNA进行逆转录生成cDNA后,应用cDNA末端快速扩增(RACE)方法扩增维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1 (VKORC1)基因3’-非翻译区和5’-非翻译区,将扩增得到的产物进行纯化后测序。测序结果与NCBI核酸数据库进行在线比较,应用生物信息学分析得到的VKORC1基因碱基序列,核苷酸序列则通过Sequencher软件进行分析,并且使用BLAST程序进行碱基比对。 结果草酸钙尿石症患者肾脏组织中VKORC1扩增后分别在3’端和5’端得到299bp和422bp的碱基片段,经过排序和拼接,得到草酸钙尿石症患者肾脏组织中VKORC1基因的cDNA全长,测序后得到证实。获得的VKORC1基因cDNA全长1174bp,包含492bp的开放阅读框(ORF,+398~+889),终止密码子下游279bp的3'UTR以及起始密码子上游397bp的5'UTR。将得到的核苷酸序列进行比对分析后,发现在得到的VKORC1的3’和5’UTR没有发现有碱基的插入或缺失,但在5’UTR新发现171bp的碱基序列。 结论VKORC1基因的3’-非翻译区与草酸钙尿石症患者肾脏组织中VKORC1的表达减少无明显相关,新发现的VKORC1基因5’端UTR序列上游区的171bp碱基序列对VKORC1活性的影响还有待于进一步研究。


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