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《华中科技大学》 2011年
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雌激素对心肌L型钙通道及钠钙交换体的调控作用及其机制研究

杨晓燕  
【摘要】:目的:长QT综合征(Long QT Syndromes, LQTs)是由基因突变或药物等因素延长心肌细胞复极所致的临床综合征,易诱发尖端扭转性室性心动过速(torsade de pointes, TdP),导致发作性晕厥、甚至心脏猝死。成年女性患者更易发生致死性的TdP。然而在幼年时,体内性激素显著增高前(男孩14岁,雄兔42日龄),雄性发生TdP的风险明显高于相应的雌性个体,这一心律失常表型的性别差异在青春期之后发生逆转。已有研究提示,雌激素是影响TdP易感性的重要因素。L型钙通道(L type calcium channel, Ca-L)功能上调可能与LQTs时心律失常易感性在成年后的逆转及EAD发生率的性别差异有关。钠钙交换体(sodium calcium exchanger, NCX)亦可能在其中发挥一定作用。在本研究中,我们观察性别、年龄和心肌部位诸因素对NCX表达的影响,并探讨雌激素调控Ca-L及NCX功能的作用及其作用机制。 方法:(1)采用主动脉逆流灌注和消化酶解方法,获得单个家兔心室肌细胞。根据实验需要,用雌激素等不同药物孵育心肌细胞。采用全细胞膜片钳技术在电压钳模式下记录ICa-L,免疫组化法分析Cav1.2a蛋白表达水平,单细胞实时定量RT-PCR检测Cav1.2αmRNA表达,以探讨雌激素对Ca-L功能的调控作用及其作用机制。在电流钳模式下记录动作电位,并以多非利特诱发EAD,以研究雌激素对LQTs时心律失常易感性的影响。(2)如(1)方法分离幼年及成年家兔心室肌细胞,采用全细胞膜片钳技术在电压钳模式下记录钠钙交换电流(Sodium calcium exchanger current,INCX)。收集幼年及成年家兔心肌组织,采用western-blot方法分析NCX蛋白表达。在Langendorff灌流的家兔心脏上,采用同步光学标测膜电位及细胞内钙,利用NCX抑制剂KB-R7943,评估NCX对E4031致心律失常作用的影响。(3)如(1)方法获得单个家兔心室肌细胞。根据实验需要,采用雌激素等不同药物孵育心肌细胞。采用全细胞膜片钳技术在电压钳模式下记录INCX,免疫组化法分析NCX1蛋白表达水平,以探讨雌激素对NCX功能的调控作用及其作用机制。雌激素或DMSO孵育24 h后,在电流钳模式下记录动作电位,并以多非利特诱发EAD,利用NCX抑制剂KB-R7943,以评估NCX对雌激素增加LQTs时心律失常易感性作用的影响。 结果:(1)与对照组相比,雌激素孵育24 h后心底部心外膜下心肌细胞ICa-L显著增加(p0.05),但雌激素并未改变ICa-LI-V曲线的形状;孵育48 h和72 h后,雌激素进一步增加ICa-L电流密度(p0.01),但并不改变Ca-L的通道门控。生理浓度范围内的雌激素(0.1-1 nM)可浓度依赖性的增加心外膜下心肌细胞ICa-L,而孕激素无此作用。雌激素可受体依赖性的上调ICa-L其作用主要由雌激素受体α介导。雌激素孵育24 h后Cav1.2a的mRNA表达和蛋白表达水平均明显增加。雌激素与转录抑制剂放线菌素D(actinomycin D, AD)和翻译抑制剂放线菌酮(cyclohexmide, HX)共同孵育后,雌激素上调ICa-L的作用被抑制。雌激素孵育24 h后,多非利特诱发心肌细胞发生EAD的风险增加,且此作用具有雌激素受体依赖性。(2)成年雄兔心底部(1.76±0.27pA/pF),心尖部(1.70±0.30pA/pF)以及雌兔心尖部(1.30±0.50pA/pF) INCX的电流密度相似,但雌兔心底部INCX的电流密度(2.59±0.32pA/pF)明显升高,与雄兔心底部及两种性别家兔心尖部INCX的电流密度相比有统计学差异(p0.05)。雌性幼兔心底部(1.21±0.25pA/pF)和心尖部(1.28±0.28pA/pF) INCX的电流密度相似(p=0.84),而雄兔心底部INCX的电流密度(3.96±0.35pA/pF)明显升高,与雄兔心尖部(2.61±0.43pA/pF)以及雌兔心尖部和心底部INCX的电流密度相比均有统计学差异(p0.05)。雄性幼兔心底部NCX1的表达较心尖部增高44%(p0.05),较雌兔心尖部NCX1表达增高52%(p0.05),较雌兔心底部NCX1表达增高64%(p0.01);而成年雌兔心底部NCX1的表达较雌兔心尖部和雄兔心肌组织的NCX1表达均高38%(p0.01)。在成年雌兔或雄性幼兔心肌中,IKr抑制剂E4031(0.5μM)灌流后可诱发EAD和TdP,然后在灌流液中加入KB-R7943(1μM),继续灌流10 min后可抑制E4031诱发的EAD和TdP。(3)培养(不含雌激素)雌兔心底部和心尖部心外膜下心肌细胞,在细胞分离后2-5 h(Day 0)、第1天(Day 1)、第2天(Day 2)和第3天(Day 3)记录INCX,在Day 0时,雌兔心底部INCX电流密度明显高于心尖部,从Day 1到Day 3,心底部INCX电流密度逐日减小,到Day2和Day 3心底部和心尖部INCX电流密度的差异消失;而来自同一心脏的心尖部INCX电流密度无明显变化。雌激素(1 nM)孵育24 h亦可增加雌兔心底部心肌细胞NCX1蛋白的表达,但对心尖部NCX1蛋白的表达无明显影响。雌激素(1nM)孵育24~72 h后,雌兔心底部心肌细胞INCX电流密度明显增加,但不影响心尖部心肌细胞INCX电流密度,对雌兔心底部心内膜下心肌细胞及雄兔心底部心外膜下心肌细胞INCX也没有影响。雌激素上调INCX的作用系经雌激素受体介导。转录抑制剂放线菌素D(actinomycin D, AD)和翻译抑制剂放线菌酮(cyclohexmide, CX)可抑制雌激素上调INCX的作用。雌激素孵育24 h后,多非利特诱发心肌细胞发生EAD的风险增加,NCX抑制剂KB-R7943可抑制多非利特诱发的EAD。 结论:性别、年龄及心肌部位等因素可影响家兔心脏INCX密度及NCX蛋白分布,其分布特点与Ca-L类似,NCX功能的性别差异影响了心律失常易感性的性别差异。雌激素可性别依赖性及部位依赖性的上调家兔心肌Ca-L及NCX的功能,此作用由雌激素受体介导,经由基因组作用调控Ca-L及NCX的功能。雌激素上调家兔心肌Ca-L及NCX的功能,可增加家兔心肌多非利特诱发EAD的易感性,是LQTs时TdP风险性别差异的重要影响因素。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R965

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