表达载体介导的Notch2基因沉默抑制人骨肉瘤侵袭和转移的实验研究

【摘要】：目的：探讨Notch2在人骨肉瘤组织中的表达量及其意义；研究靶向沉默Notch2对骨肉瘤侵袭转移的作用机制。 方法： (1)本实验我们通过免疫组化的方法来进行检测82例骨肉瘤组织中Notch2蛋白表达情况,并且结合其相关临床病理资料来分析Notch2的表达情况与其临床病理特征的关联性。 (2)我们在试验中首先是构建全长的逆转录病毒pSUPER-Notch2-siRNA质粒载体,然后通过使其稳定性的转染到PT67细胞来进行培养后,来得到其分泌Notch2蛋白病毒血用来沉默入骨肉瘤细胞株MG63细胞中Notch2的表达来实现的；通过对人骨肉瘤细胞株的干预及其沉默人骨肉瘤细胞系(MG63),是通过下列方法来实现的：常用的方法是通过体外划痕实验、Transwell侵袭实验、MTT和流式细胞仪检测等检测方法,然后我们通过研究Notch2是如何影响骨肉瘤细胞分化增殖、骨肉瘤侵袭运动的分子机制验证Notch2调控骨肉瘤发生发展分子机制导致肿瘤生物学行为的改变。 结果： (1)检测Notch2在骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达情况一般来说Notch2蛋白的阳性表达主要体现在肿瘤细胞的细胞膜或细质,颜色一般是呈棕黄色,散在性的颗粒分布。82例骨肉瘤中有64例呈阳性表达,阳性率78.1%(64/82),对照组为17.6%(6/34),这两个组之间的差异还是具有和明显的(P0.05)。Notch2在骨肉瘤中的表达明显高于在骨软骨瘤中表达,实验结果提示Notch2可能与骨肉瘤的发生发展确实有一定的关系。Notch2在骨肉瘤组织中的表达情况和其临床病理的关系Notch2蛋白表达与骨肉瘤组织组织分化程度、病理分期分级和有无转移有强的关联性(p0.05),但是肿瘤的直径大小、性别、年龄、ALP(碱性磷酸酶)等与其关联性相对不明显(p0.05)。 (2) Notch2在MG63中的表达情况与骨肉瘤的侵袭转移能力是有很强的关联性Notch2 mRNA和蛋白在MG63中的表达结果显示：在MG63人骨肉瘤细胞株细胞中与对照组比较,Notch2 mRNA和蛋白表达水平分别0.86±0.09 vs0.47±0.05,0.76±0.04vs0.22±0.08,具有显著性差异(p0.05)。 (3) Notch2在逆转录病毒介导的小RNA干扰特异性沉默MG63细胞系中的表达情况Notch2在逆转录病毒介导的小RNA干扰特异性沉默MG63细胞系中的表达相对于而言对照组而言是十分明显的,其抑制效率71%(p0.05),但是作为对照组的MG63Notch2RNAi-的表达较MG63细胞系试验中没有明显的改变,这个结果提示本研究中Notch2的表达是可以通过逆转录病毒介导的小RNA干扰来有效沉默MG63其量的表达来实现的。通过体外实验证实Notch2的表达可以影响骨肉瘤细胞的侵袭能力MG63Notch2RNAi+细胞迁移显下降,24小时划痕愈合率分别为52%vs75%,差异具有义(P0.05)。我们在实验中通过Transwell侵袭小室测定法来检测出MG63Notch2RNAi+细胞在其干预后运动能力,结果也是显示MG63Notch2RNAi+细胞运动侵袭能力是下降很明显的,计数经过约24小时细胞培养后穿过Transwell膜的每低倍视野细胞数情况计数结果分别为32.67±5.3,显示其结果还是具有较强的差异性(P0.05)。同时用MTT法来测定MG63Notch2RNAi+与其对照组的细胞增殖运动能力,结果分别为(10±1.4)%vs (18.30±2.3)%,分下后说明这两周差异还是很明显的(p0.05)。结论：该实验提示Notch2在骨肉瘤中的高表达可能与骨肉瘤的发生发展还是有一定程度的联系的,有可能作为预测骨肉瘤不良预后的肿瘤标志物的；而且Notch2有可能通过其上下游的信号分子机制一定程度上是参与了骨肉瘤的侵袭转移的；我们希望Notch2有一天能够成为抗骨肉瘤转移治疗的新途径；本研究为我们骨肉瘤的临床RNAi治疗提供了一定程度上理论依据。

【关键词】：Notch2 骨肉瘤 侵袭转移
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R738.1
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