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《华中科技大学》 2011年
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E2F1通过下调VEGF和PLGF的基因表达抑制心脏新生血管形成

吴敏  
【摘要】:E2F1通过下调VEGF和PLGF的基因表达抑制心脏新生血管形成 目的:新生血管的不足限制了心肌组织再生,导致缺血性心脏疾病的发生。研究转录因子E2F1对心肌缺血后新生血管形成的影响,寻求针对缺血性疾病基因治疗的新靶点。 方法:野生型(WT)小鼠和E2F1基因敲除(E2F1-/-)小鼠结扎心脏冠状动脉左前降支,建立心肌梗死(MI)模型。超声心电图检测两种小鼠MI术前3天及术后第7天、14天、28天小鼠心功能变化,免疫荧光染色检测MI后第7天心肌梗死周围区血管密度、内皮细胞的增殖和凋亡情况。Microarray筛选出心脏成纤维细胞缺氧时所有被E2F1调节的基因,qRT-PCR和Western blotting针对某些特异性基因(血管内皮生长因子VEGF和胎盘生长因子PLGF)在缺氧的心肌成纤维细胞的缺学的心肌中nRNA和蛋白表达水平进行验证检测。为研究E2F1-/-小鼠较WT小鼠MI后心功能史好的机制,WT小鼠和E2F1-/-小鼠建立MI模型,术后腹腔注射选择性的血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)酪氨酸激酶抑制剂SU5416或VEGFR-2阻断性抗体DC101,超声心电图检测MI术前3天及术后第7天、14天、28天小鼠心功能变化,免疫荧光染色检测MI术后第7天心肌梗死周围区血管密度、内皮细胞的增殖和凋亡情况。为研究E2F1对VEGF和PLGF的分子调节机制,应用化学试剂转染E2F1质粒与荧光素酶标记的VEGF启动子或PLGF启动子至WT和p53-/-小鼠心脏成纤维细胞中培养16小时,缺氧24小时后,根据荧光素酶活性检测VEGF和PLGF启动子活性;应用核瞬间转染装置转染E2F1质粒至WT和p53-/-小鼠心脏成纤维细胞中培养8小时,缺氧24小时后,qRT-PCR检测VEGF和PLGF mRNA水平。WT小鼠心脏成纤维细胞缺氧16小时后,ChIP assay检测p53是否结合在VEGF的启动子上。为研究缺氧时E2F1与p53分子之间的相互作用,co-IP检测内源性的E2F1和p53是否相互作用;WT和E2F1-/-心脏成纤维细胞缺氧后加入环己酰胺(CHX)或者CHX与MG132,Western blotting检测两种细胞中p53蛋白降解情况。为研究调节VEGF的E2F1分子功能结构区域,构建不同长度的E2F1突变体质粒,co-IP检测E2F1:p53相互作用区域,根据荧光素酶活性检测E2F1调节VEGF启动子的功能区域。结果:体内实验中,与WT小鼠相比,E2F1-/-小鼠MI术后心功能更好,心肌梗死面积更小,心肌梗死周围区血管密度更高、增殖和存活的内皮细胞更多。E2F1-/-小鼠缺血的心肌中血管生长因子VEGF和PLGF表达增高、p53表达降低。WT小鼠和E2F1-/-小鼠MI术后体内后给予选择性的VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂SU5416或VEGFR-2阻断性抗体DC101,两者心肌梗死周围区血管密度都明显减少、心功能间的差异明显消失。体外实验中,与WT心脏成纤维细胞相比,缺氧诱导E2F1-/-心脏成纤维细胞表达更多的VEGF和PLGF。WT心脏成纤维细胞中,过表达E2F1同时抑制VEGF和PLGF的基因表达;p53-/-心脏成纤维细胞中,过表达E2F1仅仅抑制PLGF的基因表达。缺氧的条件下,E2F1增强p53的稳定性,且其N端与p53相互作用、抑制VEGF启动子的活性。 结论:E2F1抑制VEGF和PLGF的基因表达从而抑制心脏新生血管的形成,E2F1作为基因治疗靶点可以保护心脏、减少缺血性损伤。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R542.22

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