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内质网钙释放与内皮型一氧化氮合酶在血管内皮调节中的作用和机制

肖志宏  
【摘要】:一氧化氮(nitric oxide, NO)既兼有第二信使和神经递质的功能,又是效应分子,介导和调节多种生理和病理过程[1,2]。NO的调节功能十分广泛,除了舒张血管,它还在血小板聚集,血管生成,血管平滑肌细胞的增值等方面发挥作用[3,4]。当内皮要向肌肉发出放松指令以促进血液流通时,就会产生小分子NO,它能很容易地穿过细胞膜,血管周围的平滑肌细胞接收信号后舒张,从而导致血管扩张。因此,正常生理条件下,NO在维持心血管系统稳态方面起着十分重要的作用[5]。近年来的研究发现,在几乎所有病理条件下,都伴随着内皮功能紊乱以及NO含量的异常[6]。 人体内NO主要来源于一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS),其同功酶有三种亚型,即在正常状态下表达的内皮型一氧化氮合酶(eNOS),神经元型一氧化氮合酶(nNOS)以及在损伤后诱导表达的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。作为水溶性可扩散的气体分子,NO在心血管系统不能像其他信号分子一样储存在细胞器。它的产生取决于eNOS的活化,其信号强度和作用时间长短很大程度上取决于eNOS的功能状态。因此,eNOS的激活与调控机制已经成为国际上心血管领域的研究热点。 经典理论认为,eNOS需要在钙调蛋白(CaM)结合变构之后才能活化,而后者需要在Ca2+浓度升高的条件下发生变构才能与eNOS结合[10,11]。细胞内Ca2+来源有两条途径:(1)、乙酰胆碱、缓激肽等激动剂与细胞膜上的G蛋白偶联受体结合,钙通道开放,胞外Ca2+流入胞浆[12];(2)、ATP结合内质网P2Y受体,促进钙库Ca2+释放[13]。细胞浆内Ca2+浓度升高,CaM与Ca2+结合形成Ca2+/CaM复合物,eNOS与后者结合后构象变化,使得电子流可以从还原亚基转移至氧化亚基,催化NO的生成。 除了Ca2+调控之外,蛋白质的磷酸化修饰在eNOS活性调控中也起着非常重要的作用[14]。近年来的研究发现,eNOS在丝氨酸和苏氨酸残基上容易被磷酸化,己知的对eNOS功能起关键作用的是Ser1179/1177(牛.人)。目前报导的激酶包括Akt、AMPK、PKG.CaKII等都能够磷酸化该位点,许多胞外刺激信号都可磷酸化该位点而激活eNOS。与此同时,Ser635是eNOS的另一个重要磷酸化位点,在机械剪切力作用下,PKA对Ser635位点的磷酸化显著地增强了eNOS活性[17]。与上述两个位点磷酸化均可增强eNOS活性相反的是,由PKC激活的Thr497的磷酸化能够降低eNOS的酶活性[18-20]。除了Ser1179/Ser635/Thr497之外,其它被报导的磷酸化位点还有Ser116和Ser617.相对于前三个位点来说,Ser116和Ser617位点磷酸化对于eNOS功能的影响还有待进一步研究。 尽管Ca2+和蛋白质磷酸化修饰这两种因素在调控eNOS舌性方面都起着重要的作用,但它们二者之间的相互作用目前知之甚少。我们前期的工作和最新研究资料表明:尽管CaM的结合对于eNOS活化及其重要,但是二者的结合是否一定需要高浓度的Ca2+呢?这取决于eNOS磷酸化的状态。例如,在静息水平的Ca2+浓度下,Serl 179/Ser635位点的磷酸化能够激活eNOS。显然,正是因为这两个位点的磷酸化增强了eNOS与CaM之间的亲和力[22]。另一方面,细胞内的Ca2+位移如何影响eNOS的磷酸化呢?目前仍不清楚。 在本研究中我们首次发现TG(Thapsigargin)刺激BAEC和HUVEC两种细胞,引起eNOS活化,产生NO增加现象。进一步研究发现,eNOS在Ser635位点特异性磷酸化,并且呈现时间和剂量依赖性,在半小时点达到峰值,同时我们发现这种激活作用与细胞外液Ca2+无关。因此,我们推测可能是细胞动员了钙库中的Ca2+,导致细胞浆中Ca2+浓度升高,从而激活了eNOS. 通过进一步分析,我们使用了不同的钙释放剂,包括Bradykinin和ATP同样检测到了eNOS在Ser635位点的特异性磷酸化,使用细胞内钙抑制剂]Bapta-AM有效阻止了该磷酸化修饰。这进一步证明了我们的猜测:细胞内Ca2+浓度升高导致了eNOS磷酸化。 接着,我们探究了细胞内Ca2+浓度升高与eNOS磷酸化二者之间的关系和信号转导机制。据现有报导,许多刺激信号能够通过PKA、CaMKII等信号途径在eNOS的Ser635位点进行磷酸化修饰,从而活化eNOS,增强其产生NO的能力。我们的研究显示:PKA的特异性抑制剂PKI、H89以及CaMKII的特异性抑制剂KN93均不能阻止eNOS在Ser635位点特异性磷酸化。而使用ERK1/2的特异性抑制剂PD98059和U0126均可完全阻止eNOS在Ser635位点特异性磷酸化。这些结果表明:eNOS在Ser635位点特异性磷酸化机制与PKA、CaMKII无关,而是由ERK1/2信号转导通路所介导。 综上所述,在本研究中我们发现了内质网钙释放激活了eNOS在Ser635位点特异性磷酸化,增强了eNOS的酶活性。同时,我们揭示了该信号通路系由上游激酶ERK1/2介导的生化机制。并且,我们进一步阐述了在生理条件下,ATP通过ERK1/2信号途径对Ser635位点特异性磷酸化,从而激活eNOS的调控机制。


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