抗转铁蛋白受体抗体新型分子的构建及其生物学特性研究

【摘要】：目的 利用抗TfR抗体能与肿瘤细胞表面高表达的TfR结合的特点,构建抗TfRmAb-PEG/DIR-BOA靶向纳米颗粒,观测其靶向肿瘤效应。利用多聚阳离子多聚乙酰亚胺(PEI)能够耦联带负电荷DNA的特点,构建末端带阴性寡肽尾的抗TfR-scFv-D4S×5双功能分子与PEI/DNA结合。鉴定这类抗TfR抗体新型分子与肿瘤细胞结合的特异性和生物学活性,为肿瘤的靶向定位、示踪、显像和靶向治疗研究奠定基础。 方法 1.抗TfRmAb-PEG/DIR-BOA靶向纳米颗粒的构建：①运用饱和硫酸铵沉淀法纯化抗TfR mAb, BCA法测定蛋白浓度,SDS-PAGE鉴定其纯度,FCM鉴定其与TfR的结合活性；②Traut's试剂活化抗TfR mAb二硫键,与带有DSPE-PEG(2000)-Maleimide双功能基团的PEG/DIR-BOA纳米颗粒混合孵育,构建抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA靶向纳米颗粒。 2. FPLC纯化PEG/DIR-BOA纳米颗粒和抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA靶向纳米颗粒,去除游离杂质。 3.利用抗TfR mAb, FCM技术检测不同细胞(CHO、L02、HepG2、HT1080)表面TfR的表达,利用PEG/DIR-BOA内米颗粒具有能与细胞表面SRBⅠ结合的多肽,FCM技术检测不同细胞(HepG2、HT1080)表面SRBⅠ的表达。 4.利用肿瘤细胞HT1080表面TfR和SRBⅠ的表达特点,FCM检测抗TfRmAb-PEG/DIR-BOA靶向纳米颗粒与肿瘤细胞HT1080的靶向结合活性。 5.利用生物信息学分析设计,采用重叠延伸PCR全合成适合于大肠杆菌表达的基因,通过酶切、连接等基因工程技术设计和构建不同表达载体的抗TfR-scFv-D4S×5质粒:①pET28a-6×His-scFv-D4S×5；②pET28a-scFv-D4S×5-6×His；③pGEX4T3-GST-scFv-D4S×5-8×His；④pAB1-scFv-D4S×5-6×His。 6.经IPTG诱导,原核表达抗TfR-scFv-D4S×5,12%SDS-PAGE、Western-blot鉴定不同表达载体蛋白表达。 7.常规提取可溶性蛋白或溶解包涵体,采用Ni-NTA agrose纯化蛋白,收集纯化产物经12%SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定。 8.包涵体纯化产物透析复性。 9.FCM检测抗TfR-scFv-D4S×5与肿瘤细胞HepG2、K562结合活性。 10.FCM检测抗TfR-scFv-D4S×5在肿瘤细胞K562的内吞效率,荧光显微镜检测内吞活性。 11.非变性梯度凝胶电泳鉴定抗TfR-scFv-D4S×5与PEI/DNA的结合活性。 结果 1.BCA法测定抗TfR mAb蛋白浓度约为7.5mg/mL,SDS-PAGE在55KD和25KD处可见明显条带,与理论值相符,且产物纯度可以达到90%以上。 2.FCM检测,抗TfR mAb与肿瘤细胞HepG2的结合率可达到90%左右,说明抗TfR mAb能与高表达TfR的肿瘤细胞特异性结合。 3.FCM检测发现,CHO细胞不表达TfR,L02细胞TfR表达量相对较低约为16.3%左右,肿瘤细胞HepG2和HT1080表达量相对较高,分别为90%和67%左右。FCM检测同时发现,HT1080细胞表面SRBⅠ表达量相对较低约为2.9%左右,而HepG2细胞表面表达量相对较高,约为60%左右。 4.FCM检测发现,缺乏TfR靶向性的PEG/DIR-BOA纳米颗粒与肿瘤细胞HT1080结合率仅为2.9%左右,而抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA靶向纳米颗粒与高表达TfR的肿瘤细胞HT1080结合率提高约3倍,为9.5%左右,封闭HT1080表面TfR,抑制抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA纳米颗粒与TfR结合发现其结合率下降至3.6%。 5.提取pET28a-6×His-scFv-D4S×5质粒,NdeⅠ、BamHⅠ双酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,结果可见约828bp和5300bp片段,与预期值符合；提取pAB 1-scFv-D4S×5-6×His质粒,NcoⅠ、XhoⅠ双酶切,结果可见约819bp和3000bp左右片段,与预期值符合。测序分析结果分别与预期匹配,表明表达载体构建成功。 6.37℃诱导表达条件下,诱导转化了pET28a-6×His-scFv-D4S×5表达载体的BL21菌,经12%SDS-PAGE和Western-blot检测发现,在31KD处有目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5成功表达,且表达产物以包涵体的形式存在。经Ni-NTA agrose纯化,12%SDS-PAGE检测纯化成功,BCA法测定复性后蛋白浓度约为2mg/ml。 7.37℃诱导表达条件下,诱导转化了pET28a-scFv-D4S×5-6×His表达载体的BL21菌,经12%SDS-PAGE和Western-blot检测发现,在31KD处有目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5成功表达,且表达产物以包涵体的形式存在。经Ni-NTA agrose纯化,12%SDS-PAGE检测纯化成功。 8.37℃诱导表达条件下,诱导转化了pGEX4T3-GST-scFv-D4Sx5-8xHis表达载体的BL21菌,经12%SDS-PAGE和Western-blot检测发现,在55KD处有携带GST标签目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5成功表达,且表达产物大部分以包涵体的形式存在。Ni-NTA agrose纯化,12%SDS-PAGE检测纯化成功。25℃诱导12h表达条件下,12%SDS-PAGE和Western-blot检测发现,在55KD处有携带GST标签目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5成功表达,表达产物可溶性蛋白有增加,但包涵体表达仍相对较多。 9.37℃诱导表达条件下,诱导转化了pAB1-scFv-D4Sx5-6xHis表达载体的BL21菌,经12%SDS-PAGE和Western-blot检测发现,在34KD处有携带信号肽的目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5成功表达。25℃诱导表达条件下,表达产物中可溶性蛋白表达稍有增加,但包涵体表达仍相对较多。 10.比较pET28a-6×His-scFv-D4S×5和PET28a-scFv-D4S×5-6×His表达载体BL21菌诱导表达的包涵体蛋白复性后的抗TfR-scFv-D4S×5 pGEX4T3-GST-scFv-D4S×5-8×His诱导表达的可溶性蛋白抗TfR-scFv-D4S×5三类不同表达载体表达的抗TfR-scFv-D4S×5活性,FCM检测发现,pET28a-6×His-scFv-D4S×5表达载体BL21菌表达的目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5能与高表达TfR的肿瘤细胞HepG2结合,结合率可达到80%左右,而另外两类表达载体表达的抗TfR-scFv-D4S×5几乎没有结合活性。 11.FCM检测发现,pET28a-6×His-scFv-D4S×5表达载体BL21菌表达的目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5同时能与高表达TfR的肿瘤细胞K562结合,结合率可达到80%左右。荧光显微镜观察进一步发现,抗TfR-scFv-D4S×5与TfR特异性结合后在受体介导的内吞作用下进入细胞,FCM检测内吞率可达到42.6%。 12.非变性梯度凝胶电泳证明,在多聚阳离子多聚乙酰亚胺(PEI)介导的静电作用下,这种末端携带阴性寡肽尾的抗TfR-scFv-D4S×5双功能分子能与PEI/DNA结合,具备耦联带负电荷DNA的特点。 结论1.成功构建抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA靶向纳米颗粒,并证明其具有与肿瘤细胞HT1080表面TfR的靶向结合活性,为TfR受体介导的肿瘤靶向定位、示踪、显像、靶向治疗研究奠定了良好的基础。 2.利用生物信息学分析设计,采用重叠延伸PCR全合成适合于大肠杆菌表达的基因,通过基因工程技术成功构建TfR-scFv-D4S×5原核表达载体,其表达量显著高于原鼠源性亲本抗体基因密码子序列,并且证明表达产物抗TfR-scFv-D4S×5双功能分子既具备与肿瘤细胞表面TfR结合的活性和受体介导内吞作用,又可以在PEI的介导下,通过阴性寡核苷酸尾与质粒DNA结合。从而为抗TfR-scFv在肿瘤的靶向定位、示踪、显像,以及靶向生物治疗研究奠定了基础。