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《华中科技大学》 2011年
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SMART文库筛选新基因C20orf108参与肿瘤细胞线粒体凋亡途径方式及其机制

刘佳  
【摘要】:第一部分SMART技术平台的建立和HDAC抑制剂诱导凋亡新机制的探讨 研究背景 细胞凋亡是一种程序性细胞死亡的机制,生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下,其死亡途径被激活,并在有关基因的调控下发生的程序性死亡过程,是正常机体对生理或病理信号引发的自主性的细胞清除过程。而在肿瘤细胞内逃避细胞凋亡是肿瘤的一大标志,也是肿瘤治疗失败的主要原因之一。认识肿瘤凋亡途径的特异性调控方式是认识肿瘤,治疗肿瘤的必要手段。近年来开发出一大类HDAC抑制剂具有广泛的抗肿瘤效应,是发现肿瘤特异性分子靶点的良好切入点。运用Suppression of Mortality by Antisense Resuce Technique(SMART)技术,从HDAC抑制剂特异性诱导肿瘤细胞凋亡的角度入手,筛选出了一系列凋亡相关基因,认识肿瘤凋亡途径的特异性调控方式,能够为肿瘤的治疗提供新的科学依据和药物作用靶点。 实验方法 Trichostatin A诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡反义cDNA文库的构建和凋亡效应基因的筛选及鉴定Trichostatin A处理人乳腺癌MCF-7后,于不同时间点收集细胞。提取细胞的总RNA并且分离纯化mRNA并且逆转录成cDNA,将cDNA片段随机的插入到质粒pCEP4形成SMART文库,反义cDNA文库40μg转染HeLa细胞,空载体作为对照。转染48h后,Trichostatin A (150nmol/L)与HYB(200ug/L)的联合筛选12d后,检查存活的细胞克隆插入的基因。 结果 经过MTT比色法,及流式细胞术检测证实250nmol/L TrichostatinA能诱导人MCF-7和HeLa细胞的凋亡,并使用TRIZOL提取处于凋亡不同时期的MCF-7细胞总mRNA。提取mRNA逆转录后得到的反义cDNA文库片段插入率大于90%,片段平均长度约为1.5kb,库容约为2×105;将此文库质粒DNA转染HeLa细胞,经过筛选得到阳性克隆后,Hirt DNA提取转化,经酶切测序获得76个EST片度。所获得片段进行生物信息学分析后,选取若干基因开展后续工作,对其中的C20orf108,Liv-1和Ubiquitin B进行了详细的机制研究。 结论 1.建立HDAC抑制剂TrichostatinA诱导肿瘤细胞凋亡的模型。 2.利用SMART技术平台和生物信息学分析,筛选得到76个效应克隆。 3.对文库筛选出来的效应克隆C20orf108、Liv-1和Ubiquitin B进行了详细的机制研究。 目的 阐述C20orf108抵抗HDACi诱导细胞凋亡的机制及其功能方法 运用SMART技术(Suppression of Mortality byAntisense Rescue Techique)筛选出新基因C20orf108,合成其siRNA,构建正义表达质粒,PCR检测其在不同细胞株的表达情况,运用流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,免疫荧光和WESTEN-BLOTING检测细胞定位,免疫共沉淀技术寻找其相互作用蛋白。 结果: 本试验证实在MCF-7和HeLa细胞内降低C20orf108的表达可以抵抗HDACi引起的细胞凋亡,增高C20orf108的表达能够促进细胞凋亡,并且这种效应是依赖与线粒体凋亡途径的。C20orf108定位于线粒体内,并且参与了内源性细胞凋亡途径的调控。 结论: 1.C20orf108是一个调控细胞凋亡的新基因,在肿瘤细胞和正常细胞存在表达差异,并参与了线粒体凋亡途径的调控。 2.对文库筛选出来的基因C20orf108参与线粒体凋亡途径调控的方式进行了详细的机制研究。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R730.2

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