重组腺相关病毒-LIGHT对小鼠宫颈癌模型的治疗作用研究

【摘要】：第一部分(Part I) 重组腺相关病毒-LIGHT对小鼠宫颈癌模型的 治疗作用研究 [摘要]目的构建含肿瘤坏死因子超家族成员14(LIGHT)的重组腺相关病毒(rAAV-LIGHT),探讨(rAAV-LIGHT)对TC-1细胞株所建立的小鼠宫颈癌模型的抑瘤效应的可行性。方法用基因重组方法构建含LIGHT全长的重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-LIGHT-hrGFP,磷酸钙沉淀法将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞中,分别合成rAAV-LIGHT和rAAV-GFP。并用实时荧光定量PCR测病毒滴度。RT-PCR检测rAAV-LIGHT对TC-1细胞的转染效率。体外用淋巴毒性试验来检测LIGHT的免疫效应。小鼠细胞系TC-1(转染过E6E7RAS)用于建立小鼠宫颈癌模型。成瘤第3天对空白对照组(5只小鼠),rAAV-GFP(5只小鼠), rAAV-LIGHT(5只小鼠)组分别进行肌肉注射。观察其生物特性及用实时定量PCR检测肿瘤微环境中LIGHT和其他细胞因子的表达情况。观察rAAV-LIGHT的抑瘤效应。通过流式细胞仪和肿瘤组织HE染色、免疫组化检测小鼠淋巴细胞增值效应。结果成功构建并鉴定了rAAV-LIGHT和rAAV-GFP,滴度为2.5×1010 v.g/ml,转染效率为60%。SPSS13.0分析结果显示rAAV-LIGHT组肿瘤大小明显小于对照组及rAAV-GFP组(P=0.0055,P=0.029 P0.05)。对照组及rAAV-GFP组比较无明显统计学意义(P=0.115 P0.05)。结论rAAV-LIGHT可在小鼠宫颈癌模型逆转肿瘤生长。 第二部分 (Part 2)携带小鼠HVEM的重组腺相关病毒载体的构建及鉴定 【摘要】目的克隆小鼠疱疹病毒侵入介体(HVEM)基因,构建其重组腺相关病毒载体,鉴定目的基因在真核细胞中表达,为免疫基因治疗奠定基础。方法用RT-PCR法从小鼠脾脏淋巴细胞克隆出全长HVEM基因,构建携带HVEM基因的穿梭质粒pAAV-IRES-HVEM-hrGFP和辅助质粒pAAV-RC,pHelper利用磷酸钙共沉淀法将穿梭质粒共转染入AAV-293细胞中,采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺相关病毒rAAV- HVEM。用氯仿-PEG8000法纯化病毒,实时荧光定量PCR测病毒滴度。RT-PCR检测rAAV- HVEM在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达情况。结果成功构建组装重组小鼠HVEM腺相关病毒,纯化后病毒滴度为5×1010 v.g/mL,且在CHO转导细胞中能有效表达目的基因。结论构建的重组腺相关病毒载体rAAV-HVEM为组织工程相关细胞转基因构建及临床应用提供先进的载体系统。为今后进一步研究HVEM的功能及其应用奠定基础。

【关键词】：腺相关病毒 LIGHT 宫颈癌 免疫治疗 疱疹病毒侵入介体 腺相关病毒 基因治疗
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R737.33
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