药用旱生植物刺山柑悬浮培养体系建立及抗逆性初步研究

【摘要】：刺山柑在生态和经济方面都具有较大的开发利用价值。目前,由于自然分布少,资源量日渐下降等因素制约,影响了其在生产中的应用。植物细胞培养被认为是解决此资源危机的理想途径。本文围绕刺山柑愈伤组织聚集体理化性质、悬浮培养过程中的生长及代谢特征、刺山柑适应逆境环境的初步机制和刺山柑植株挥发油成分及含量测定等基础领域,开展了较为全面的研究。主要研究结果如下： (1)根据细胞直径的不同,分拣出3种不同大小的刺山柑细胞聚集体,对它们进行了黄酮含量、相关酶活性及再培养曲线的测定。结果表明颗粒最小的细胞聚集体黄酮含量约为颗粒较大的细胞聚集体的2倍,并且其丙二醛含量、苯丙氨酸解氨酶及过氧化物酶的活性及再培养曲线均具有相同的变化趋势。个体较小的与氧气、培养基养分接触充分,利于细胞生长与次生代谢物的积累。 (2)对刺山柑细胞悬浮培养的生长过程和营养物质消耗进行动态研究。结果表明：培养液的pH值在4.2-5.8之间变化,呈现先降后升的趋势；培养基中的磷酸盐、硝酸盐基本满足刺山柑细胞的生长,大量元素的消耗速率为P043-NH4+N03-,在大量元素中无机磷消耗最快。细胞的生长与氮、磷元素的消耗以及细胞内外蛋白含量变化相吻合。刺山柑细胞可溶性蛋白呈现单峰型,先升后降变化,与胞外可溶性蛋白有良好的线性关系。 (3)研究了干旱胁迫对旱生植物刺山柑相关生理指标的影响,以考察其耐旱特征及抗旱机制。结果表明：4%-10%的浓度范围内,随着PEG-8000胁迫浓度的增加和胁迫时间的延长,刺山柑愈伤组织中丙二醛含量升高,可溶性蛋白含量先上升后降低,脯氨酸含量上升,过氧化物酶活性上升,质膜过氧化作用加强,脂肪酸不饱和度增大。表明细胞膜系统和保护酶系统遭到破坏并表现出初步抗旱机制。PEG浓度大于10%时对细胞产生不可逆转的伤害。 (4)探讨了温度胁迫对刺山柑愈伤组织生理生化的影响。试验结果表明,在低温胁迫下,刺山柑细胞发生了质膜过氧化作用,导致产物丙二醛含量升高,过氧化物酶活性上升；渗透调节物质可溶性糖、可溶性蛋白以及游离脯氨酸含量升高,不饱和脂肪酸含量增加,用以提高其耐寒性。 (5)通过GC-MS的方法,对刺山柑果实和种子中的挥发油成分进行鉴定。发现刺山柑干果及种子主要含有不饱和酸类、烷类、酚类、和酯类等成分,其中不饱和脂肪酸类所占比例最大。