HLA-A2/CD35scFv融合蛋白在昆虫杆状病毒载体系统中的表达与纯化

【摘要】：人主要组织相容性抗原HLA I类分子广泛分布于几体内各种有核细胞表面，主要由重链(Hc)、轻链(Lc)与抗原肽非共价结合而成，可提呈特定的表位供特异性T细胞识别。利用HLA I类分子与单链抗体的融合可将特定的抗原肽／HLA复合物加载到目的细胞表面，目前研究主要应用于加载HLA分子到肿瘤表面。cD35分子又名补体受体1(cRl)，是一种单链膜结合蛋白，主要分布于红细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等细胞表面。利用几红细胞表面的cD35分子作为靶点，有可能通过HLA分子与cD35单链抗体的融合将HLA分子加载到红细胞表面，将其作为单一表位的抗原提呈细胞或者几工靶细胞。其中cD35单链抗体是由免疫球蛋白的重链可变区(vH)和轻链可变区(vL)通过一段链接肽连接而成的重组蛋白，具有分子量小，免疫原性低，半衰期短，穿透力强的优点。在本实验室的前期工作中已经成功构建HLA．A2／cD35scFv融合基因，但前期的研究结果显示原核表达的HLA．A2／cD35scFv融合蛋白由于其结构的复杂性，很难在体外正确复性，直接限制了HLA-A2／cD35scFv融合蛋白的获得与应用。本研究拟利用杆状病毒表达系统，通过双表达载体pFaStBaTMDua1在草地贪夜蛾卵巢细胞sf9中表达HLA-A2胞外段(a1，a2.a3区)和cD35单链抗体融合基因(HLA-A2／cD35scFv)及B2m基因，利用真核细胞的修饰体系，使HLA-A2／cD35scFv正确折叠，并通过离子交换层忻的方法进行纯化，以获得具有正确空间构象且纯度较高的HLA-A2／cD35scFv融合蛋白。主要实验内容和结果如下： 一、pFastBac~(TM)Dual+[p2m+HLA-A2／cD35scFv]昆虫杆状病毒表达载体的构建。 利用PCR技术从pET-28a+[HLA-A2／CD35scFvl中扩增HLA-A2／CD35scFv融合基因，并通过两端酶切位点(salI和Hindlll)插入pFastBac~(TM)VDual启动子PH下游，构建形成pFaStBac~(TM)Dua1+[HLA-A2／cD35scFv]质粒。同样的方法从pET-22b+[B2m]质粒中以B2-微球蛋白的cDNA为模板进行扩增，获得的产物经(Sma I、Nhe I)双酶切后插入到pFastBac~(TM)Dual+[HLA-A2／cD35scFv]质粒中，获得pFastBac~(TM)Dual+[B2m+HLA-A2／CD35scFv]质粒。经酶切鉴定和测序分忻，昆虫杆状病毒表达载体构建成功。 二、重组穿梭质粒的获得与鉴定，重组蛋白的表达、纯化与鉴定 将重组质粒pFastBac~(TM)Dual+[p2m+HLA-A2／CD35scFv]转化E.coil DHl0Bac~(TM)，PCR鉴定结果显示穿梭载体Bacmid含B2m与HLA-A2／CD35scFv目的基因。提取鉴定正确的重组质粒Bacmid DNA，利用脂质体转染昆虫sf9细胞，收获转染后重组病毒用于sf9细胞扩增感染。病毒感染后的sf9细胞分泌重组蛋白到培养上清中，用仅与天然构象的HLAI类分子结合的单克隆抗体W6／32与抗几B2m抗体进行双抗夹心ELISA检测，证实获得具有正确空间构象的HLA-A2／CD35scFv融合蛋白。由pI/Mw批量计算器[expasy]得知，重组蛋白HLA-A2／CD35scFv的理论等电点(pI)为6.12，BSA的等电点(pI)为4.7，因此选择阴离子交换层忻的方法对收获的含融合蛋白上清进行纯化，利用W6／32与抗几B2m抗体进行双抗夹心ELISA检测到纯化后的蛋白浓度(14ug／m1)，变性Western blotting显示分子量为70kD，与预期结果一致。HLA-A2／CD35scFv融合蛋白能够与红细胞表面CD35分子结合，但结合率较低，约为4.4％。 本研究显示，昆虫杆状病毒表达载体系统可以有效的表达出具有空间构象的HLA-A2／CD35scFv重组蛋白，通过阴离子交换层忻的方法可以使含重组蛋白的培养上清有效纯化，且纯化后的融合蛋白与红细胞具有一定的结合能力。使HLA-A2／CD35scFv融合蛋白通过CD35分子作为靶点与红细胞有效结合成为可能，为以后制备几工抗原递呈细胞或者几工靶细胞奠定了基础。