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锌指结构转录因子Osterix在氟性骨损伤骨周化骨中的分子作用机制研究

马俊香  
【摘要】:氟性骨损伤(fluoride bone injury, FBI)骨周化骨是一种特殊的异位骨化形式(Heterotopic ossification,HO),其主要临床表现为广泛性骨质增生/硬化、骨软化、骨质疏松、骨间膜、肌键和韧带钙化等。国内外关于FBI的研究大多集中在氟(fluoride, F)对骨细胞的损伤方面,对F导致骨关节硬化方面的研究较少,而后者才是导致慢性FBI患者致瘫致残的重要原因。 成纤维细胞(fibroblast,FB)起源于胚胎间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),具有多分化潜能,在在F的刺激作用或某些病理条件下,这些FB还可进一步向成骨细胞(osteoblast, OB)转化,进一步在非骨组织内发生钙化,引起HO。因此,本实验选择具有成骨潜能的FB作为研究对象,通过建立体外染F模型,并对不同染F剂量组和时间段的染氟成纤维细胞(fibroblast exposed to fluoride, FBEF)的活力和增殖活性进行了初步鉴定,并在此基础上,进一步研究了F对锌指结构转录因子Osterix(Osx)和骨钙素(Osteocalcin, Ocn)转录和表达的影响。初步分析了:1)引起FB向成骨表型转换的最佳染F时间剂量;2)Osx和Ocn在此转换过程中转录或表达的变化情况,分析引起二者变化的最佳染F时间和剂量,并进一步分析二者转录或表达之间的相关性;3)检测Osx和Cbfα1在职业性F暴露人群中的表达水平;4)探讨Osx和Cbfα1在FBI骨周化骨过程中的作用机制,进一步阐明F-FB-FBI骨周化骨三者之间的关系。 本研究主要由以下三部分组成: 第一部分不同染氟剂量组和染氟时间段染氟成 纤维细胞的增殖活性 目的:建立体外传代培养小鼠FB L929染F模型,探讨F对小鼠FB L929活力和增殖活性的影响,为第二部分的试验确定合适的染F剂量和染F时间。方法:传代培养的小鼠FB L929分别预设七个染F剂量组:0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、20mg/L,9个染F时间段:1、2、4、8、12、24、48、72、96h,采用台盼蓝排斥试验法,观察不同染F剂量组和不同染F时间段FB的存活情况;用MTT法测定FBEF的增殖活性。 结果:1)细胞活力:与对照组相比,0.1、1、10和20mg/L剂量组活细胞率明显下降(p0.05),仅20mg/L剂量组的活细胞率小于50%;2)细胞增殖活性:0.0001mg/L和0.001mg/L剂量组,几乎在各染F时间段FB的增殖活力均增加(p0.05),其中在12、24和48细胞活性增加比较明显(p0.05);0.01mg/L和0.1mg/L剂量组,只有12、24、48和72h细胞活性增加(p0.05),其余各组均随染F时间的延长和染F剂量的增加,细胞增殖活性呈现明显下降趋势。 结论:1)F对FB的活力有抑制作用,染F剂量与FB活细胞率呈现明显的剂量-效应关系;2)F对FB的增殖活性的影响呈现一定的剂量-时间-效应关系,即短时间-低剂量的F明显增强FB的增殖活力,随着染F剂量的增加和染F时间的延长,FB的增殖活力明显减弱。确定后续实验的染F剂量为0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10mg/L,染F时间为2、4、8、12、24、48、72、96h。 第二部分锌指结构转录因子Osterix和骨钙素在染氟成纤维细胞中的表达 目的:检测Osx和Ocn基因在FBEF中的转录和蛋白表达,探讨Osx和Ocn在FBI骨周化骨中作用机制。 方法:1)Osx和Ocn蛋白的检测:将传代培养小鼠FB L929分别暴露于以下6个不同的染F剂量组:0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10mg/L,分别按8个时间段进行染F:2、4、8、12、24、48、72、96h,分别采用Western blot和Elisa法,分别检测Osx和Ocn蛋白在每个染F时间段和染F剂量组的FBEF中的表达量;2)Osx和Ocn mRNA基因的检测:将传代培养小鼠FB L929分别暴露于以下6个不同的染F剂量组:0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10mg/LNaF,分别染F 24、48、72h后,提取各个剂量组和染F时间段的mRNA进行逆转录,然后采用荧光实时定量PCR的方法,对各个剂量组和染F时间段的mRNA进行相对定量。 结果:1)Osx蛋白的检测结果:①与对照组相比:染F 12和48h,0.0001和1mg/L剂量组Osx表达量升高比较明显(p0.05);染F 24h,0.0001、0.01和0.1 mg/L剂量组Osx表达量明显升高(p0.05);染F 72h,1和10mg/L剂量组Osx表达量明显升高(p0.05);染F 96h,仅在0.001mg/L剂量组Osx表达量明显升高(p0.05);②与8h相比:染F 12h的0.0001和1mg/L剂量组和染F 48h的1mg/L剂量组Osx表达量明显升高(p0.05);染F 24h时几乎所有剂量组的Osx表达量均明显升高(p0.05);染F 72~96h时大部分剂量组的Osx表达量均明显降低(p0.05);总的来看,在各染F剂量组Osx表达量在24h时达最高,其余剂量组,随着染F时间的延长Osx蛋白的表达量呈逐渐降低的趋势;2)Ocn蛋白的检测结果:①与0 mg/L组相比,染F 24h,0.001、0.1和10mg/L剂量组的Ocn浓度显著性增高(p0.05);染F 48~96h,10mg/L剂量组的Ocn浓度明显升高(p0.05);②与8h相比,染F 24h的大部分剂量组和染F 72h的10mg/L剂量组的Ocn浓度呈明显升高(p0.05);染F 48~96h,各剂量组中的Ocn浓度呈明显下降趋势;总的来看,各剂量组的Ocn浓度随着染F时间的延长有降低的趋势,个别剂量组在24h时则明显上升;3)Osx mRNA基因的检测结果:染F 24和48h时,各个剂量组Osx mRNA的转录水平均呈增高趋势,尤其在1和10mg/L剂量组中增加比较明显(p0.05);染F 72h时Osx mRNA的转录水平总体呈现下降趋势,仅在1和10mg/L剂量组转录水平有所增加;4)Ocn mRNA基因的检测结果:染F 24h,Ocn mRNA的转录水平较对照组明显增高(p0.05);染F 48h,各剂量组的Ocn mRNA转录水平总体呈现先下降后升高的趋势;染F 72h,各个剂量组Ocn mRNA的转录水平则呈现先升高后下降的趋势,但Ocn mRNA的转录水平均较对照组高。结论:1)F可促进Osx和Ocn基因在FBEF的转录和表达,而且Osx和Ocn基因的转录和表达呈现时间-效应关系,24h的0.0001mg/L剂量组和48h的1mg/L剂量组是引起Osx蛋白表达的最佳条件,引起Osx mRNA转录的最佳时间-剂量则为24h和48h的10mg/L剂量组;2)染F可刺激FB向OB的转化,并促进Osx基因的转录和表达,并进一步促进成骨标志性基因Ocn的转录和表达,Osx基因可能是FBI骨周化骨过程中重要的调控基因。 第三部分锌指结构转录因子Osterix和核心转录因子Cbfα1在不同职业性氟负荷人群中的检测 目的:在蛋白表达水平上,观察Osx和Cbfα1在不同职业性F负荷人群中的表达,探讨Osx和Cbfα1在FBI骨周化骨中的作用机制。 方法:选取湖北某铝业集团连续工作5年以上的男性工人为研究对象,然后根据F负荷(血F和尿F浓度)将观察对象分为三组:对照组(血F0.16mg/L且尿F2mg/L),低F负荷组(0.16mg/L≤血F0.25mg/L且2mg/L≤尿F4mg/L)和高F负荷组(0.25mg/L≤血F且4mg/L≤尿F),采用Elisa法分别检测血清Osx和Cbfα1的含量。 结果:1)血氟和尿氟检测结果:中F负荷组和高F负荷组的尿F浓度与对照组相比明显升高(p0.05),而血清F仅在高F负荷组升高较明显(p0.05);与中F负荷组相比,高F负荷组的血清F和尿F均明显升高(p0.05);2)血清Osx和Cbfα1检测结果:①与对照组相比,中F负荷组的血清Osx浓度明显升高(p0.05),而血清Cbfα1升高却不太明显;②与中F负荷组相比,高F负荷组血清Osx和Cbfα1的浓度均明显降低(p0.05)。 结论:Osx和Cbfα1基因可能是FBI骨周化骨过程中两个比较重要的调控基因,而且血清Osx变化较Cbfα1更明显,在成骨过程中更具特异性。因此,可以初步推测血清Osx和Cbfα1可能是FBI早期损伤诊断的参考指标,尤其是Osx可能是FBI骨周化骨过程中重要的调控点之一。


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