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《华中科技大学》 2010年
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携带GAD_(67)基因真核表达载体的构建及转染骨髓基质细胞的研究

谢三平  
【摘要】:[研究背景] 癫痫(Epilepsy)是临床常见疾病,我国癫痫患病率约为5‰,全国有约600~700万病人,可见于各个年龄段。目前癫痫的治疗主要靠药物来控制其发作,虽然抗癫痫药物有效治疗率可达80%左右,可使70%左右的患者病情得到完全缓解,但还有20%左右的患者不能被药物所控制,或因药物毒副作用无法用药而成为难治性癫痫。而且抗癫痫药仅抑制癫痫发作,并不能逆转癫痫灶的病理改变,阻止癫痫的自然进程,且多数抗癫痫药不良反应大,服药时间长,价格较贵,给患者及其家庭带来了沉重的负担。所以探求一种新的安全、有效的治疗手段不但意义重大而且十分必要。很多研究都提示,癫痫的发病与癫痫灶内GABA能神经元的变性缺失有关:GABA能神经元功能相对或绝对不足导致兴奋性与抑制性神经功能失衡引起脑内异常放电而导致癫痫发作。而且研究发现神经干细胞(NSCs)癫痫灶内移植后对癫痫可起到治疗作用,但由于NSCs主要来源于胚胎存在其自身的势弱限制了其广泛应用。因此,我们依据癫痫的病理生理学改变试图探索谷氨酸脱羧酶基因修饰的骨髓基质细胞于癫痫灶内定向移植后对癫痫的治疗作用及可能机制。 [目的] 构建携带人类GAD67基因的真核表达载体pDC316-CMV-EGFP-GAD67并转染大鼠骨髓基质细胞,观察其转染效果及转染后GAD67基因在骨髓基质细胞中的表达。 [方法] 利用基因重组技术,用Not I、Spe I分别对pCMV6-XL5-GAD67质粒进行酶切获得GAD67基因片段,然后将其插入pDC316-CMV-EGFP质粒构建pDC316-CMV-EGFP-GAD67真核表达载体,经酶切、测序鉴定正确;通过转基因技术利用脂质体将其导入通过贴壁方法分离培养出来的骨髓基质细胞,荧光显微镜下观察、流式细胞仪检测其转染效率,免疫组化检测GAD67基因的表达。 [结果] 经酶切、测序鉴定证实成功构建pDC316-CMV-EGFP-GAD67真核表达载体,其中插入有3.5kbp的人类GAD67 cDNA,转染骨髓基质细胞后荧光显微镜下观察可见大量带绿色荧光的细胞,经流式细胞仪检测其转染效率为37.3%,免疫组化检测证实GAD67基因在转染后的BMSCs中呈阳性表达。 [结论] 成功构建pDC316-CMV-EGFP-GAD67真核表达载体,且脂质体可有效介导人类GAD67基因转染骨髓基质细胞,为进一步研究基因修饰的骨髓基质细胞癫痫灶内定向移植治疗癫痫奠定了实验基础。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R742.1

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