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《华中科技大学》 2010年
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高剂量叶酸补充孕小鼠与子代结肠EDNRB表达关系在先天性巨结肠症发病机制作用初步探索

林学科  
【摘要】:目的首次在国内尝试用RHAA配方建立孕小鼠高剂量叶酸(high-dose folic acid, HFA)补充模型,并对该模型进行评价,以求初步阐明环境因素(高叶酸饮食)与胚胎发育及个体患某疾病风险之间的关系提供一些前期实验资料。 方法选用同窝未经产的健康8-10周龄的雌性C57BL/6小鼠60只,体重18-20克,按体重排序,随机分成五组,分别用一组低叶酸的RHHA配方饲料饲养(0mg FA/kgdiet)三组高剂量叶酸的RHHA配方饲料饲养(40,160和320mg FA/kgdiet)另一组正常叶酸的RHHA配方饲料(2mg FA/kgdiet)饲养作为对照组。两周后与雄鼠进行合笼,于怀孕第二十天(孕足日)对孕鼠行剖腹取胎。每周记录体重及摄食量两次。对动物于实验前、交配前、孕晚期末和胎鼠的血清叶酸浓度进行检测。并对该模型进行评价及观察不同浓度的叶酸含量膳食对胎鼠生长发育的影响。 结果1.交配前后,各实验组动物每天平均摄食量、体重的增长量、食物效能与对照组相比,无显著性差异。可见不同含量叶酸饮食对孕鼠的发育影响不大。 2.与对照组相比,各高叶酸组(40,160和320mg FA/kgdiet)和低叶酸组胎鼠的平均体重和鼻-臀长均小于对照组(p0.05)。可见高、低叶酸饮食均会减缓胎儿生长。 3.随着添加叶酸膳食剂量的增加,母体及胎儿血清叶酸浓度也随着相应增加,直止160mg FA/kg饲料饮食,动物体内叶酸水平达到最高值。低叶酸膳食组在合笼前(叶酸限食两周后),动物平均血清叶酸水平(SFA)明显低于实验前,至孕晚期末动物体内SFA下降至最低,达实验前的37%左右,合笼前的50%左右(P 0.01)。同时也发现胎鼠SFA高于母体。 4.对照组(2mg FA/kgdiet)因膳食中添加叶酸,合笼前SFA略高于实验前(P 0.05),至妊娠晚期末SFA78%左右(P0.01),说明孕小鼠SFA水平因生理性妊娠而明显下降。 结论用40-160mg FA/kgRAHH配方饲料能成功构建孕小鼠高叶酸模型,并发现该模型仔鼠生长发育减缓。为今后验证环境(高叶酸饮食)是否能够通过表观遗传学机制诱导子代某些特定基因位点异常甲基化进而调控其基因表达,最终导致其子代表型变化及个体今后发病风险奠定实验基础。 目的探讨妊娠期间母体饮食中叶酸含量的高低对子代个体EDNRB/EDN3/ ECE1信号传导通路基因和HD表型的影响,了解肠道内环境因素中的高叶酸饮食因素,在HD发病机制中的可能作用,以及在HD预防中的潜在应用价值 方法选用同窝未经产的健康8-10周龄的雌性C57BL/6小鼠50只,体重18-20克,按体重排序,随机分成五组,分别用一组低叶酸(0mg FA/kgdiet)RHHA配方饲料饲养,三组高叶酸补充的RHHA配方饲料饲养分别为40,160和320mg FA/kgdiet,另一组正常叶酸的RHHA配方饲料(2mg FA/kgdiet)饲养作为对照组。饲养两周后与雄鼠进行合笼,于怀孕末期处死上述不同叶酸饮食环境下出生的子代小鼠,分别观察上述五组仔鼠发育并取胎鼠的结肠组织观察是否具有HD表型并拍照。分别用高效液相色谱-离子肼质谱联用(HPLC-MS/MS),亚硫酸盐测序(BSP),实时定量PCR和Western-blot技术分别对各实验组胎鼠结肠样本基因组DNA甲基化改变情况及EDNRB基因启动子区域甲基化模式有无异常进行检测,并对不同叶酸饮食下出生的子代小鼠血清叶酸水平与结肠组织基因组DNA甲基化水平及ENDNRB基因启动子甲基化做相关分析,并分析甲基化模式异常与其表达改变可能存在的联系。 结果1.分别在40,160和320mg FA/kgdiet叶酸补充膳食组发现巨结肠表现,发生率分别为1/42(2.4%),2/33(6.1%)1/36(2.8%)。 2.与对照组相比,叶酸缺乏模型动物和高叶酸补充模型的胎鼠结肠组织基因组DNA甲基化水平高于对照组,除了叶酸缺乏组外(P0.05),其余各组均没有显著性差异。 3.各叶酸含量膳食组(0,2,40,160和320mgFA/kgdiet)动物EDNRB基因启动子上游区域(-228~-815)共有35个甲基化位点,其甲基化状态分别为(20.1%,18.8%,25.1%,22.1%,22.6%),CpG岛甲基化位点主要集中在(-594,-597,-652)位点上,而且这些位点甲基化程度与胎鼠体内血清叶酸水平成正相关。 4.高叶酸组结肠组织Ct值(EDNRB mRNA表达水平)随膳食叶酸含量的增加而减少。其中(40,160和320mg FA/kgdiet)组与对照组Ct相比较,有显著性差异(P0.05)。低叶酸组结肠组织Ct值高于对照组比,差异有统计学意义(P0.01)。EDNRB蛋白在各实验组胎鼠结肠组织均有表达。与对照组相比,高剂量叶酸膳食组EDNRB蛋白表达水平下降不明显。 结论高叶酸补充模型动物有结肠扩张表现,并初步证实了妊娠期间高叶酸饮食可诱导其子代EDNRB基因启动子上游区域CpG岛及甲基化位点胞嘧啶甲基化状态均增加,并与其mRNA表达下降存有一定的联系。这为HD预防和治疗提供理论基础和实验资料。同时也为今后合理指导妊娠期间母体叶酸供给提供初步的实验资料。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R735.2

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