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《华中科技大学》 2011年
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微流控芯片细胞钙信号研究

孙建  
【摘要】:钙离子是一种普遍的细胞内信使,其浓度的时空变化及相关的信号转导过程调控基因的表达,从而影响甚至决定细胞的行为。所以,研究单细胞钙信号以及钙信号在细胞间的传递对于揭示众多生理过程的机制、攻克人类疾病意义重大。微流控芯片已成为细胞研究的新型平台,本文将微流控芯片用于细胞钙信号的研究,取得了以下创新性结果: (1)搭建了一套基于微流控多路层流的细胞局部给药系统并用来化学诱导细胞间钙信号转导,即钙波。细胞经负压脉冲引入Y形微通道并精确定位在靶区域内,待细胞贴壁后,用钙离子荧光探针孵育细胞。根据靶细胞与通道内壁的距离设置微注射泵的流量速度,正压驱动三磷酸腺苷(ATP)和缓冲液流体进入微通道形成两路层流,使得靶细胞的局部暴露于ATP中、毗邻细胞暴露于缓冲液中。发现钙信号从靶细胞传递到毗邻细胞中,且传递方向和流体方向相反,说明该钙波并不是由靶细胞释放ATP扩散到毗邻细胞介导的;当在缓冲液中加入辛醇抑制间隙连接后,钙波消失,说明钙波主要是由间隙连接介导的。 (2)利用双负压系统实现了化学药物毫秒刺激单细胞。细胞经相同的负压脉冲接种于十字微通道的靶区域内,控制通道出口端的两路负压使得微通道中ATP和缓冲液的流体状态在水力门控和水力聚焦之间快速切换,在靶细胞附近发生快速溶液交换(17 ms),形成毫秒长短的ATP脉冲流经细胞。结果表明20μM ATP刺激细胞100 ms使得细胞表面受体脱敏最小化,受体在50 s内即可完全恢复活性,从而实现同一个细胞对照试验。固定ATP浓度为20μM,变化刺激时间从50 ms到100 ms再到1 s,钙峰峰高持平;固定刺激时间为100 ms,变化ATP浓度从2μM到20μM再到200μM,钙峰峰高递增,严格证明了ATP诱导的钙释放是浓度依赖的。然而,当ATP在低浓度时,变化刺激时间从30 ms到50 ms再到100 ms,钙峰峰高递增,揭示ATP诱导的钙释放又是时间依赖的。 (3)利用双负压系统实现了对细胞化学微环境的时空控制,建立了一种研究细胞间信号转导的新方法。水力门控和水力聚焦相互切换后,靶细胞附近的溶液交换可在100 ms左右完成;水力聚焦时,ATP扩散宽度~25μm。成功实现了对靶细胞的局部时间可控性给药,引发了钙波。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:TN911.6;TN492

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