收藏本站
《华中科技大学》 2011年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

抗转铁蛋白受体四价抗体(TfR-TeAb)的构建、表达和鉴定

刘颖  
【摘要】:目的为提高抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)的亲和力,在前期研究工作成功构建抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)原核表达载体的基础上,本实验构建和表达抗转铁蛋白受体四价抗体(TfR-TeAb),鉴定其生物学活性,为抗转铁蛋白受体抗体在肿瘤诊断和治疗研究中的进一步应用奠定基础。 方法①以pET28a-TfRscFv-D4S×5为模板,设计两条引物引入酶切位点NcoⅠ和EcoRⅠ,通过PCR方法扩增出TfR-scFv的片段。将TfR-scFv片段克隆到质粒pET28a–HSA-p53载体上,获得重组质粒pET28(a)-TfR-TeAb,转化大肠杆菌BL21,挑选单克隆菌株,并扩增,提取质粒后酶切,测序鉴定;②将大肠杆菌阳性克隆在37℃用IPTG诱导表达后,进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,确定抗体最佳表达时间和表达部位;③Ni~(2+)-NTA亲和层析柱纯化包涵体蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定;④将纯化后的蛋白进行梯度透析复性,再用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)分析活性蛋白的空间构象;用流式细胞术(FCM)检测蛋白与高表达TfR的肝癌细胞系HepG2结合活性,并在荧光显微镜下观察。 结果①测序结果显示TfR-scFv和HSA-p53基因序列及开放阅读框正确无误,表明TfR-TeAb原核表达载体构建成功;②表达载体转化大肠杆菌BL21后,37℃,经IPTG诱导4h表达量最高,细胞亚定位分析结果显示蛋白主要以包涵体形式表达;③大量诱导表达后,收集包涵体蛋白,经Ni~(2+)-NTA层析柱纯化,Western-blot显示纯化蛋白分子量的大小为36kD,与理论值相符合;④纯化蛋白经梯度透析复性后,Native -PAGE结果显示抗体蛋白以四聚体形式存在,分子量大小与TfR单克隆抗体和人IgG相近,约为144kD。FCM分析和免疫荧光显微镜观察,结果显示TfR-TeAb能与TfR表达阳性的HepG2细胞特异性结合且结合率与TfR-scFv相比有明显提高。结论①成功构建了TfR-TeAb原核表达载体;②目的蛋白在大肠杆菌BL21中以包涵体的形式表达;③复性后的TfR-TeAb能与TfR阳性细胞特异性结合,且亲和力较TfR-scFv有明显的提高。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R730.3

手机知网App
【共引文献】
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 杨娟;抗TfR抗体偶联物靶向抗瘤效应及其杂交瘤细胞株轻链基因分析[D];华中科技大学;2011年
2 胡荷宇;抗转铁蛋白受体抗体新型分子的构建及其生物学特性研究[D];华中科技大学;2011年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 肖铣德,许岸高,凌红;转铁蛋白受体单克隆抗体与导向碘油混悬剂治疗中晚期肝癌的疗效观察[J];中国肿瘤临床;1996年09期
2 李强;陈明;;病毒性肝炎铁代谢异常的研究[J];医学综述;2007年14期
3 张雅鸥,廖清奎;铁对转铁蛋白受体表达的调节[J];国际输血及血液学杂志;1992年01期
4 黄贵清,廖清奎,李丰益,罗春华,杨先军;小儿急性白血病转铁蛋白受体和铁代谢状况的研究[J];中国小儿血液;1997年01期
5 张豪,沈明山,方宏清,王明刚,陈惠鹏;转铁蛋白/转铁蛋白受体介导的药物运输[J];中国生物工程杂志;2004年06期
6 张劭夫,刘树芬,刘书盈,徐军,孙晓明,武翠华;慢性肺心病急性发作期淋巴细胞IL-2R及转铁蛋白受体的变化[J];现代免疫学;1993年04期
7 聂建民,林焕馨,林华锦,梁星群,张俊慧;转铁蛋白受体在儿童白血病骨髓血细胞中表达及其意义[J];中国小儿血液;1998年03期
8 ;健康成人血清可溶性转铁蛋白受体的测定[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;1999年03期
9 张玉忠 ,张雪林;转铁蛋白受体与磁共振分子影像学研究近况[J];国外医学.临床放射学分册;2004年05期
10 钟志容;何勤;刘戟;;转铁蛋白及其受体作为药物载体的研究进展[J];沈阳药科大学学报;2006年10期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 申宝忠;王凯;王可铮;王知非;黄涛;李伟华;王丹;;转铁蛋白受体报告基因MR分子成像监测内皮抑素基因表达及治疗效果[A];中华医学会第16次全国放射学学术大会论文汇编[C];2009年
2 吴志坚;张永学;;~(99m)Tc-转铁蛋白肝细胞癌转铁蛋白受体显像实验研究[A];中国核学会同位素分会第四届理事会暨学术报告会论文汇编[C];2004年
3 肖代雯;沈昕;邢薇;黄宇;雷萍;朱慧芬;刁智娟;刘红云;沈关心;;抗TfR双价抗体的构建、表达及其鉴定[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年
4 李强;李丰益;廖清奎;罗春华;;人胎盘微绒毛膜的制备及其转铁蛋白受体放射分析法建立[A];第五届全国优生科学大会论文汇编[C];2000年
5 李红霞;;43例妊娠妇女血清贫血检测指标的分析[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年
6 陆盛军;孙伟;李瑜;梁智辉;翁秀芳;陈雪琳;严永祥;钟茂华;李佳楠;吴雄文;;大鼠源性杂交瘤TIB219的IgG轻、重链可变区基因克隆和序列分析[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年
7 丁健;林琳;郑彦;杭纬;颜晓梅;;铍的细胞摄入机制探讨[A];中国化学会第26届学术年会化学生物分会场论文集[C];2008年
8 袁媛;周新;;HBG1和TFRC基因的克隆与原核表达[A];第八次全国医学遗传学学术会议(中华医学会2009年医学遗传学年会)论文摘要汇编[C];2009年
9 胡瑞海;赵明辉;;转铁蛋白受体和免疫球蛋白A/M Fc受体并非人系膜细胞主要的IgA_1受体[A];“中华医学会肾脏病学分会2004年年会”暨“第二届全国中青年肾脏病学术会议”论文汇编[C];2004年
10 刘峻;原续波;康春生;刘洁;浦佩玉;盛京;;转铁蛋白表面修饰聚乳酸载药超微粒子靶向释药治疗大鼠脑胶质瘤研究[A];2005年全国高分子学术论文报告会论文摘要集[C];2005年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 记者 陈勇毅 通讯员 李亚平;中医药治再障明显优于西药铁剂[N];中国中医药报;2005年
2 本报记者 刘艳芳 整理;探求可靠的生化指标[N];中国食品报;2008年
3 本版编辑编译;青蒿素与癌症治疗[N];医药经济报;2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王进;补脾法对脾虚证大鼠~(59)Fe代谢和转铁蛋白受体mRNA表达影响的实验研究[D];湖北中医学院;2004年
2 丁为民;核素显像活体示踪脊髓内移植干细胞[D];中国人民解放军军医进修学院;2004年
3 姜嫣嫣;主动靶向肿瘤细胞的转铁蛋白-PEG-rHuTNF-α复合物的研究[D];复旦大学;2005年
4 彭吉林;内质网滞留型抗TfR胞内抗体的构建及其对肿瘤细胞增殖与凋亡的影响研究[D];华中科技大学;2007年
5 马龙;不同躯体应激对大鼠脑铁代谢的影响及机制研究[D];第二军医大学;2008年
6 姜宏;中枢神经系统铁代谢与帕金森病关系的研究[D];青岛大学;2004年
7 洪鸣凰;聚乙二醇化羟基喜树碱转铁蛋白修饰隐形纳米载药系统的肿瘤靶向研究[D];复旦大学;2009年
8 叶庆;抗TfR基因工程抗体诱导肿瘤细胞凋亡及其靶向肿瘤基因表达与效应研究[D];华中科技大学;2006年
9 江广斌;转铁蛋白受体MR分子探针Tf-SPION的合成及初步在体研究[D];华中科技大学;2012年
10 李征;IONP-PLL进入细胞机制的研究及其在基因治疗中的应用[D];中南大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 秦鑫;从噬菌体肽库中筛选与人转铁蛋白受体特异性结合的肽[D];第四军医大学;2004年
2 潘素敏;重组犬转铁蛋白受体抑制犬细小病毒感染的研究[D];河北农业大学;2010年
3 肖代雯;抗TfR单链抗体及其双价抗体的构建、表达及鉴定[D];华中科技大学;2006年
4 颜丽;转铁蛋白与阿霉素复合物的制备及其评价[D];暨南大学;2005年
5 钟志容;肝癌细胞靶向转铁蛋白修饰的载基因前阳离子脂质体给药系统研究[D];四川大学;2007年
6 代维;抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的构建,表达及特异性研究[D];华中科技大学;2007年
7 范雪瑾;孕母铁贮备与新生儿铁水平关系研究[D];浙江大学;2005年
8 黄苇苇;转铁蛋白与重金属离子Cd~(2+)、Zn~(2+)结合反应的方波极谱法研究[D];河北师范大学;2008年
9 刘颖;抗转铁蛋白受体四价抗体(TfR-TeAb)的构建、表达和鉴定[D];华中科技大学;2011年
10 匡荣仁;青蒿琥酯对急性白血病原代细胞凋亡及转铁蛋白受体表达的影响[D];广州中医药大学;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026