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《华中科技大学》 2010年
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Fas/FasL信号转导通路在PBDE-47致SH-SY5Y细胞凋亡中的作用

赵国栋  
【摘要】:多溴联苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一种目前受到全球关注的新型持久性有机污染物(persistant organic pollutant, POPs),因其具有阻燃效率高、热稳定性好、对材料性能影响小、添加量少和价格便宜等诸多优点,PBDEs作为多氯联苯(polychlorrinated biphenyls, PCBs)的替代物广泛应用于电子电器设备、自动控制设备、建筑材料、家具和纺织品等商业化产品中。20世纪80年代发现环境中存在PBDEs污染,随后的监测发现PBDEs广泛存在于空气、水、土壤、各种沉淀物以及野生动物、鱼类、家禽和人类,而且其暴露水平呈逐年升高的趋势。近年来,大量体内和体外实验发现,PBDEs可对人体健康造成多种危害,包括神经毒性、肝脏毒性、生殖毒性、致癌作用及内分泌干扰作用等。动物试验研究结果表明,在鼠大脑发育关键期暴露低剂量的PBDEs可导致成年鼠脑功能紊乱,主要表现为学习记忆功能缺损和自主行为紊乱,且随年龄的增长而症状加重,此外,母源性暴露PBDEs可导致仔鼠海马神经元数量减少且形态结构发生改变,进而导致神经系统发育异常和学习记忆功能障碍。因此,目前PBDEs的神经发育毒性越来越受到人们的关注。然而,PBDEs神经毒性的研究工作仍处于起步阶段,多集中于学习记忆和神经行为等神经毒效应方面,而对PBDEs神经毒作用机制方面的研究涉及较少且不明确,因此,针对PBDEs神经毒作用的机制展开研究,将有利于我们深层次地认识PBDEs神经毒性特点,为日后预防和控制PBDEs的神经毒作用提供理论依据。 细胞凋亡是多细胞动物中的高度进化保守途径,在胚胎发育和维持细胞动态平衡中有十分重要的作用,细胞凋亡过程的异常与诸多疾病的发生和发展存在密切的联系,而且与许多外源化合物的毒性作用有重要关系。本实验室前期的研究发现,PBDEs同系物PBDE-47可诱导原代培养的海马细胞和人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞发生氧化应激和细胞凋亡;此外,Madia等实验研究发现PBDE-99可引起人脑星形细胞瘤细胞凋亡。进一步的研究发现,PBDE-47诱导SH-SY5Y细胞凋亡与caspase-3、caspase-12、细胞色素C和DAPK mRNA表达水平升高有关,表明PBDE-47可能通过三条经典凋亡途径(线粒体、内质网和死亡受体等途径)诱导SH-SY5Y细胞凋亡,但具体哪条通路是PBDE-47诱导细胞凋亡的主要途径及其作用机制尚不清楚,有待进一步研究。Fas/FasL信号通路是一种典型的细胞凋亡死亡受体信号转导通路,且作用机制目前比较明确。近年来研究表明,神经系统普遍表达Fas和FasL,且在多种神经性疾病中其表达明显升高,提示Fas/FasL系统在神经系统中具有重要作用。目前,关于Fas/FasL信号通路在PBDEs神经毒性中的作用尚未见报道。 基于上述理由,本实验拟通过培养SH-SY5Y细胞接触不同剂量的PBDE-47,观察PBDE-47对细胞凋亡率、caspase-3、Fas、FasL、caspase-8基因和蛋白表达水平的影响,从而探讨Fas/FasL信号通路在PBDE-47致SH-SY5Y细胞凋亡中的作用。 本研究主要由以下二部分组成 第一部分PBDE-47对SH-SY5Y细胞凋亡、Fas、FasL、procaspase-8、procaspase-3蛋白和caspase-3、Fas mRNA表达水平的影响 目的:探讨PBDE-47对SH-SY5Y细胞凋亡率、Fas、FasL、procaspase-8、procaspase-3蛋白和caspase-3、Fas mRNA表达水平的影响。 方法:体外培养的SH-SY5Y细胞暴露于不同浓度的PBDE-47(1、5、10μmol/L),以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照组,染毒24 h后,应用流式细胞术、Western blot和RT-PCR技术分别检测细胞凋亡率、Fas、FasL、procaspase-8、procaspase-3蛋白和caspase-3、Fas mRNA的表达水平。 结果:10μmol/L PBDE-47染毒组细胞的早期凋亡率和总凋亡率明显高于对照组、1、5μmol/L PBDE-47染毒组(P﹤0.05);与对照组相比,各染毒组procaspase-3蛋白表达均明显下降(P0.05);而各染毒组Fas和procaspase-8蛋白表达与对照组相比差异均无统计学意义(P0.05);1μmol/L PBDE-47染毒组FasL蛋白与对照组相比表达升高(P0.05),但5、10μmol/L PBDE-47染毒组FasL蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义(P0.05);与对照组相比,各染毒组caspase-3 mRNA表达均明显升高(P0.05);而各染毒组Fas mRNA表达与对照组比较差异均无统计学意义(P﹥0.05)。结论:一定剂量的PBDE-47可诱导SH-SY5Y细胞凋亡,引起caspase-3 mRNA表达升高和procaspase-3蛋白表达下降,然而Fas、FasL、procaspase-8蛋白和Fas mRNA表达却没有变化。 第二部分Fas受体拮抗剂ZB4对PBDE-47致SH-SY5Y细胞凋亡和procaspase-3蛋白表达的影响 目的:探讨Fas受体拮抗剂ZB4对PBDE-47致细胞凋亡和procaspase-3蛋白表达的影响。 方法:体外培养的SH-SY5Y细胞暴露于10μmol/L PBDE-47和/或Fas受体拮抗剂ZB4,DMSO为溶剂对照组,染毒24 h后,检测细胞凋亡率和procaspase-3蛋白表达情况。 结果:Fas受体拮抗剂ZB4单独暴露对细胞凋亡率和procaspase-3蛋白表达没有影响(P﹥0.05);与PBDE-47单独染毒组相比,ZB4与PBDE-47联合染毒对SH-SY5Y细胞凋亡率和procaspase-3蛋白表达没有明显变化(P﹥0.05)。 结论:结合第一部分实验结果,说明Fas/FasL信号转导通路可能没有参与PBDE-47诱导SH-SY5Y细胞凋亡的过程。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R363

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