当归多糖参与正常机体铁代谢的分子机制研究

【摘要】：铁调素hepcidin是机体铁代谢中关键的负性调节因子。Hepcidin的表达异常会引起体内铁缺乏或铁超载,进而引发一系列与铁代谢紊乱有关的疾病。Hepcidin调节剂的发现和研制将为铁代谢障碍性疾病的防治提供新的方向和途径。本实验室前期研究得出,当归中的主要活性成分当归多糖可参与机体铁代谢增加肠道铁吸收,推测与hepcidin的表达调控有关。为进一步探讨当归多糖参与正常机体铁代谢的作用,本实验研究了当归多糖对正常大鼠体内hepcidin表达的抑制作用及具体抑制机理;并建立了人hepcidin稳定转染的HepG2细胞系,为当归多糖直接作用肠道铁吸收的体外研究提供实验基础。 第一部分当归多糖对正常大鼠体内hepcidin表达的抑制作用及分子机制研究 对当归多糖抑制hepcidin表达的活性进行探讨,并对其抑制机制进行研究。采用水提,酸碱除蛋白的方法提取当归饮片中的当归总多糖。所得到的产物糖含量稳定保持在70%以上,不同批次间重复性好,为后期的药理实验打下基础。 以腹腔注射rhEPO(2000IU/kg, q.d.×3)为阳性对照,灌胃生理盐水(1mL, q.d.×14)为阴性对照,对大鼠每天灌胃当归多糖溶液(1g/kg),给药14d;于给药前及末次给药后不同时间点,大鼠内眦取血,ELISA法检测血清中EPO和hepcidin的含量。SPSS软件进行数据处理,分析当归多糖刺激机体内源性EPO分泌的药效时间关系,以及抑制hepcidin表达的活性与宏观抑制机制。实验结果表明当归多糖可显著提高体内EPO分泌水平,给药后4h达到最高值;同EPO一样,当归多糖也可显著抑制hepcidin表达,hepcidin受抑制程度与体内EPO分泌的激活程度呈正相关。当归多糖具有抑制hepcidin表达的药理作用,初步推测其主要抑制机制是通过刺激机体总红细胞生成活性的类EPO途径,此研究结果为进一步研究当归多糖抑制hepcidin表达的分子机制打下基础。 考察当归多糖及EPO对hepcidin主要调控通路中关键信号分子的作用活性,包括:JAK-STAT通路中的STAT3/5和pSTAT3/5、HJV/BMP-SMAD途径中的SMAD4以及红细胞生成调控途径中的C/EBPα,以阐明当归多糖抑制hepcidin的具体分子机制。另取一批大鼠,进行同上分组及给药。阳性对照组(rhEPO组)末次给药8 h后,实验组(ASP组)及阴性对照组末次给药24 h后,大鼠浅麻醉,肝脏在体灌注以除去血液,western blot检测肝脏内目标信号蛋白的表达水平。采用图像分析软件Image Plus Pro 6.0对显影胶片进行分析,SPSS软件进行组间差异显著性分析。初步得出当归多糖与EPO抑制hepcidin表达的具体机制如下图所示:图Ⅰ当归多糖及EPO抑制hepcidin表达的分子机制 当归多糖(ASP)通过下调转录调控因子STAT3/5及SMAD4的表达量,并通过刺激内源性EPO分泌而进一步下调肝细胞内信号蛋白水平,最终抑制hepcidin表达;EPO则通过减弱JAK激酶引起的STAT3/5磷酸化、下调C/EBPα和SMAD4的含量,从而导致激动因子减少,HAMP启动子活性减弱,hepcidin表达下降。 第二部分肠道铁吸收调控模型--人hepcidin稳定转染HepG2细胞系的构建 构建人hepcidin全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达hepcidin的HepG2细胞系,以应用于当归多糖参与肠道铁吸收调控的体外研究。化学合成结合PCR扩增拼接hepcidin全长结构基因,插入原核表达载体pMD18-T中,测序正确后再经HindⅢ与EcoRⅠ双酶切,定向插入真核表达载体pcDNA3.0内,酶切鉴定后,采用脂质体转染法将重组质粒转染人HepG2细胞,G418选择抗性细胞克隆,ELISA检测转染细胞hepcidin的蛋白表达。经酶切鉴定,成功构建hepcidin真核表达载体pcDNA3-hepcidin;重组质粒转染HepG2,经G418筛选3周获得抗性细胞克隆,其hepcidin蛋白表达量为普通HepG2细胞表达量的3倍,即成功构建了稳定高表达hepcidin的HepG2细胞系。